Purificación y caracterización de D-Xilosa-deshidrogenasa de hígado de cerdo

Abstract

Se describe la purificación y caracterización de la D-xilosa-NADP+-deshidrogenasa de hígado de cerdo enzima detectada anteriormente, pero que no había sido purificada ni caraterizada. La D-xilosa-NADP+-deshidrogenasa se purificó hasta homogeneidad aparente a partir de citosol de hígado de cerdo. El procedimiento comprende las siguientes etapas. 1. Preparación de extracto crudo; 2. Cromatografía en CM-Sephadex; 3. Precipitación con sulfato de amonio entre 45 y 70% de saturación; 4. Cromatografía de intercambio iónico en DEAE-сеlulosa; 5. Cromatografía de filtración en Sephacryl S-300; 6. Cromatografía en hidroxilapatita; 7. Cromatografía de seudo afinidad en azul-agarosa. La preparación final tiene una actividad específica de 6,1 ± 0,7 unidades/mg (n=6) de proteína. A partir de 300 g de hígado se obtienen mediante este procedimiento 0,92 ± 0,3 mg (n=6) de enzima purificada entre 1500 a 2300 veces, con un rendimiento de 15 ± 5%. Las preparaciones presentan una sola banda de proteínas en geles de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio. La enzima es estable durante por lo menos 4 meses de almacenamiento a 4° C en presencia de EDTA, monotioglicerol y fenilmetilsulfonilfluoruro. La masa molecular relativa de la enzima, medida por cromatografía de exclusión en Sephacryl S-300, es de 62.000 ± 1.300 (n=3). Por electroforesis en geles de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio se calculó un valor de M de 32.100 ± 900 (n=4), lo que sugiere que la enzima nativa es un dímero de unidades con la misma masa molecular relativa. Los estudios cinéticos muestran valores de K de 7,5 m mM y 0,11 mM para los sustratos D-xilosa y NADP+ respectivamente. La enzima puede oxidar varios sustratos glucídicos, pero la especificidad ( relación kct/Km) es mucho mayor ap para D-xilosa. El valor de la constante de especificidad para esta pentosa es 6 y 11 veces mayor que para D-ribosa y L-arabinosa respectivamente, que son aldopentosas que difieren en la orientación de un grupo hidroxilo con respecto a D-xilosa. Este estudio de especificidad sugiere que el mejor sustrato es una pentosa cuya configuración más probable es la de la B-D-xilopiranosa, con orientación ecuatorial de los grupos hidroxílicos de los carbonos 2, 3 y 4. Con respecto a la afinidad por el nucleótido, la enzima es específica para NADP+; NAD+ no es reducido en presencia de D-xilosa u otras pentosas. En estudios de velocidad inicial para analizar e! efecto de las variaciones de concentraciones de uno de los sustratos D-xilosa y NADPt a concentración constante del otro sobre la actividad de la enzima las gráficas de dobles recíprocos muestran líneas paralelas. No se efectuaron otros estudios que pudieran confirmar la sugerencia de un mecanismo ping-pong para la unión de los sustratos a la enzima. El aislamiento y caracterización de la D-xilosa-deshidrogenasa permitirá la investigación de las vías metabólicas de utilización de la D-xilosa en mamíferos. La existencia de esta vía degradativa hace suponer que la pentosa puede catabolizarse, evitando el ciclo de los pentosas-fosfatos.

The purification and characterization of D-xilose dehydrogenase from pig liver is decribed. The enzymes had been previously detected in that organ but not purified or characterized. D-xylose-NADP+-dehydrogenase was purified to apparent homogeneity from the cytosol of frog liver. The protocol is as follows: 1. Preparation of crude extracts; 2. CM-Sephadex Chromatography; 3. Ammonium sulfate precipitation at 45-70% saturation; 4. Anionic chromatograhphy in DEAE-cellulose; 5. Exclusion chromatography in Sephacry! S-300; 6. Hydroxyl-apatite chromatography; 7. Seudo-afinity chromatography in blue 2-agarose. From 300 g of liver tissue 0.92 ± 0.3 mg (n+6) of purified enzyme were obtained with yield of 15 ± 5%. The purified enzymed was stable at least during 4 months if stored at 4° in a buffer containing EDTA, monothioglycerol and phenyl-methyl-sulfonyl-flouride. Specific activities of 6.1 ± 0.7 units/mg (n=6) protein were observed in the final preparation. of A relative molecular mass of 62.000 ± 1300 (n=4) was obtained by exclusion chromatography on Sephacryl S-300. Polyacrylamide electrophoresis in the presence of sodium dodecyl sulfate revealed a value of 32.100 ± 600 suggesting that the native enzyme is a dimer of subunit of similar or identical size. Kinetic studies showed K values of 7.5 mM and 0.11 mM for D-xylose and NADP+, respectively. The enzyme can oxidise several others sugars but the especifity (k/K catm ap quotient) is higher for D-xylose than for D-ribose or L-arabinose. These aldopentoses differ from D-xylose in the orientation of one hydroxyl group. that the best substrate for Specifity studies suggest the enzyme is a pentose whose conformation is B-D-pyranose with equatorial orientation of the hydroxyl groups at carbons 2, 3 and 4. i.e., B-D-xylopiranose. The enzyme is specific for NADP; NAD is not reduced in the presence of D-xylose or other pentoses. Initial velocity data when D-xylose or NADP+ concentrations were varied at fixed concentratios of the nucleotide or the sugar, respectively, revealed a pattern of parallel lines when expressed as double reciprocal plots. Further studies to confirm this suggested ping-pong mechanism were not performed. The isolation and characterization of this D-xylose dehydrogenase will allow the investigation of metabolic pathway(s) of xylose utilization in mammals. The presence of D-xylose by a pathway other than the pentose phosphate pathway.