Estudio comparativo de hexoquinasa A de rata y hexoquinasa de cerebro de pollo

Abstract

En cerebro de mamíferos y de pollo se encuentra una actividad hexoquinásica asociada a la mitocondria. En el caso de mamíferos tal actividad corresponde a una isoenzima específica (hexoquinasa A), de las cuatro presentes en varios tejidos. En el caso del pollo no es claro que sea hexoquinasa A la enzima presente en mitocondrias de cerebro. Para abordar este problema se hizo necesario purificar a homogeneidad la actividad hexoquinásica presente en cerebro de pollo, estudiar sus propiedades У establecer sus posibles relaciones de homología con la hexoquinasa A de cerebro de rata. Se diseñó un protocolo de purificación para la hexoquinasa de cerebro de pollo que implica la solubilización de la enzima de las mitocondrias con glucosa-6-P y cromatografías en DEAE-celulosa, hidroxilapatita, Sephacryl S-300 y agarosa azul-2. La enzima se purificó 219 veces (a partir de las mitocondrias) y se logró una actividad específica de 47 U/mg de proteína. Cuando la preparación se sometía a electroforesis en geles de poliacrilamida en presencia de SDS, se obtenía un sola banda de proteina. Los valores de KK para glucosa y ATP de la hexoquinasa de cerebro de pollo fueron 0,13 mM y 0,45 mM, respectivamente. EI valor de K para glucosa obtenido es diferente al de la m isoenzima A de rata (0,06 mM) y similar al de la hexoquinasa B de rata (0,15 mM). La masa molecular relativa, calculada a partir de los resultados de la filtración a través de Sephacryl 5-300 y electroforesis en condiciones desnaturantes, fue aproximadamente 100.000, lo que coincide con el estimado para hexoquinasa А у otras de rata. Se prepararon sueros inmunes contra hexoquinasa A de rata y hexoquinasa de cerebro de pollo y se caracterizaron por su efecto sobre la actividad de las enzimas que se usanon como an tígenos y por microinmuno-ensayo (ELISA). Los sueros inmunes mostraron ser específicos para el antígeno ya que no presentaron reacción cruzada cuando se midió su capacidad de inhibir la actividad hexoquinásica. Sin embargo, estos sueros presentaron reacción cruzada cuando se midió su capacidad de unión a la enzima mediante la técnica ELISA. Se comparó la reactividad inmunológica de hexoquinasa A de cerebro de rata y de cerebro de pollo por inmunoadsorción en placas con anticuerpos monoclonales dirigidos contra la enzima de rata. Los resultados indicaron que varios de estos anticuerpos reconocen epitopos en la enzima de cerebro de pollo. Cromatografías en columnas de DEAE-celulosa (en idénticas condiciones) de las isoenzimas de cerebro de rata y de cerebro hígado de pollo mostraron que la movilidad cromatográfica de hexoquinasa de cerebro de pollo es diferente a la de hexoquinasa obtenida de cerebro de rata y, en cambio, es muy similar a la de la hexoquinasa I de hígado de pollo. La identidad de la hexoquinasa de cerebro y hexoquinasa de hígado de pollo pudo demostrarse mediante el suero inmune anti-hexoquinasa de cerebro de pollo, el que fue capaz de inhibir la actividad enzimática de la hexoquinasa I pero no de la hexoquinasa Il de higado. El tratamiento de la hexoquinasa de cerebro de pollo con tripsina generó cuatro fragmentos que tienen aproxi madamente las siguientes masas moleculares: 92.000, 63.000, 53.000, 43.000. La hexoquinasa A de cerebro de rata en condiciones similares generó el mismo número de fragmentos cuyas masas aproximadas fueron: 92.000, 64.000, 54.000 y 42.000. Al comparar la migración electroforética de las enzimas utilizando geles de poliacrilamida en placa con un gradiente transversal de poliacrilamida en condiciones nativas, la hexoquinasas de cerebro de pollo y cerebro de rata presentaron distinto comportamiento en presencia y ausencia de ligandos. En ausencia de ligandos, la isoenzima de cerebro de rata presentó una forma molecular mayoritaria que correspondería al monómero. En las mismas condiciones, la isoenzima de cerebro de pollo presentó varias formas moleculares que corresponderían a monómero, dímero y trimero. En presencia de glucosa-6-P, es posible apreciar dos formas moleculares en la hexoquinasa de cerebro de rata, mientras que en cerebro de pollo hay varias. En presencia de ATP en ambas enzimas predominó el estado monomérico. La composición aminoacídica de la hexoquinasa de cerebro de pollo es parecida a la de las hexoquinasas de mamíferos.

Mammalian brain cells contain an hexokinase activity associated to mitochondria, which has been shown to correspond to hexokinase A, one of the four isozymes found in different tissues. Chicken brain also contains a mitochondrial hexokinase activity, but it is not known to what type of isozyme did it correspond. In order to establish the identity of this hexokinase activity, I have purified chicken brain hexokinase to homogeneity, and studied its properties and possible relationships to rat brain hexokinase A. The purification procedure employed involved: solubilization of the mitochondrial enzyme with glucose-6-P, fol lowed by chromatography in DEAE-cellulose, hidroxyapatite, Sephacryl S-300 and Agarose Blue-2. The enzyme was purified 219 fold (from mitochondria) and the final specific activity was 47 U/mg. When submitted to run in pol yacrilamide-SDS gels, only one band was detected. Km values for glucose and ATP were 0.13 mM and 0.45 mM, respectively. The Km for glucose was different to that obtained for the rat brain isozyme (0.06 mM), and similar to that of rat hexokinase B (0.15 mM). The relative molecular mass, calculated from the results of Sephacryl S-300 chromatography and of the SDS electrophoresis, was approximately 100,000, which agrees well with that estimated for rat hexokinases A, B and C., Immune sera were prepared against 'either rat hexokinase A or chicken brain hexokinase. Both sera were characterized related to their effect on the activities of the two enzymes, as well as by ELISA microimmuno-assay. Each serum specifically inhibited only the activity of its corresponding antigen, but it showed cross reactivity when assayed by ELISA. Monoclonal antibodies to rat hexokinase were used to further clarify the immunological relationship of chicken brain hexokinase to the rat brain hexokinase A. Results revealed that several monoclonal antibodies to rat hexokinase do recognize epitopes in the chicken brain hexokinase. DEAE-cellulose chromatography of both enzymes (under the same conditions) revealed that the chromatographic mobility of the chicken brain hexokinase was different to that of rat brain hexokinase A, and rather similar to that of chicken liver hexokinase I. The antiserum prepared against chicken brain hexokinase was able to inhibit the activity of chicken liver hexokinase 1, but not that of hexokinase 11, thus establishing the immunological identity of those isoenzymes. Trypsin digestion of chicken brain hexokinase produced four fragments of the following approximate molecular masses: 92,000; 63,000; 53,000 and 43,000. Same treatment of rat brain hexokinase under same conditions produced four fragments: 92,000; 64,000; 54,000 and 42,000. The two enzymes were also compared by electrophoresis in slab gels with a transverse pore gradient in the absence of denaturing agents. The rat brain isozyme migrated mainly as a monomer in the absence of ligands, while the chicken brain hexokinase migrated as monomer, dimer and trimer. Conversely, in the presence of gl ucose-6-P, the rat brain isozyme was present in two forms, while that of chicken brain migrated as several forms and the presence of ATP, both enzymes migrated mainly as monomer. The aminoacid composition of the chicken brain hexokinase was found to be similar to those of other mammalian hexokinases.