Estudios sobre la metilación y fosforilación de las proteínas de los ribosomas cloroplásticos y citoplasmáticos de Euglena gracilis

Abstract

Los ribosomas son las particulas que sintetizan proteinas en la célula. Se encuentran presentes en toda clase de organ i smos de sempeñando la misma función, por lo que han sido un excelente material para estudios evolutivos. Sin embargo, existen diversos tipos de ribosomas. En or gan i smos vegetales y ciertos protozoos se han descrito tres clases diferentes de ribosomas: el citoplasmático, el cloroplástico y el mitocondrial. Analizando el RNA ribosomal 165 en varios organismos y en base a una serie de otros antecedentes, Woese ha propuesto una clasificación de los seres vivos en la que se postulan tres grupos, los que se originaron de un supuesto antepasado común denominado progenote y que son las arquebacterias, las eubacterias y los eucariontes. Lo interesante es que esta clasificación apoya la hipótesis de un origen endosimbionte para el cloroplasto y la mitocondr ia. tres Como 1os ribosomas ejercen el mismo papel en los tipos de organi smos, los componentes de la particula deberian estar conservados. De acuerdo con esto, las modificaciones post-sintéticas de los componentes ribosomales tales como las metilaciones, las fosforilaciones, etc. también podrian estar conservadas. En este sentido, recientemente se ha demostrado en el laboratorio que las metilaciones de las proteinas ribosomales son aparentemente conservadas en las eubacterias con un patrón de metilación caracteristico. Encontramos varias proteinas metiladas, algunas de las cuales participan activamente en la función ribosomal. De acuerdo a estos hallazgos, y teniendo en cuenta el planteamiento de la hipótesis de un origen endosimbiótico para los cloroplastos, hemos querido extender nuestros estudios sobre la modificación de protefnas del aparato traduccional para establecer si los clororribosomas presentan también metilaciones y/o fosforilaciones de suS proteinas y si estas modificaciones coinciden o no con el patrón determinado para las eubacterias. Se estudió la metilación in vivo de los ribosomas de E. gracilis creciendo las células en presencia de <3H-metil)metionina y (1-14C)metionina. Se obtuvieron las proteinas ribosomales de l0s clororribosomas o de los ribosomas citoplasmáticos por los métodos convencionales. La separación de las proteinas se efectuć mediante electroforesis bidimensional en geles de poliacrilamida. E1 grado de metilación fué determinado midiendo la razón 3H/14с de cada protefna. Encontramos que en los ribosomas de cloroplastos el número de protefnas metiladas Y Su distribución en geles de electroferesis bidimensional es similar a las de los procariontes. Para aportar mayores antecedentes en este sentido se analizaron también los aminoácidos metilados encontrándose cantidades similares de Lis(Me 3) y Lis(Me) en los ribosomas de cloroplasto tal como ocurre en los ribosomas de E. coli. En cambio, los ribosomas citoplasmáticos presentan canti dades diferentes de ambos aminoácidos metilados. Estos resultados parecen sugerir que existiria un cierto grado de conservación y una similitud entre el patrón de metilación de los clororribosomas y e1 patrón de metilación de "tipo eubacteriano". Por otro lado se estudió la fosforilación in viva de las proteinas ribosomales de E. oracilis, creciendo las células en presencia de (32p)ortofosfato. En estas condiciones se detectaron sólo 2 proteinas fosforiladas en los clororribosomas y 5 proteinas fosforiladas en 1os citorri bosomas. Los residuos fosfori lados encontrados en ambos tipos de ribosomas fueron serina y treonina, siendo la razón treonina/serina de 1,9 para 1os ribosomas de cloroplastos y de 1,1 para los ribosomas citoplasmáticos. En conclusión, los estudios de estas modificaciones post-sintéticas de las proteinas ribosomales de bacterias y cloroplastos y aquellos ya publicados anteriormente por otros grupos, permiten sugerir que las metilaciones de1 aparato traduccional aparentemente presentan un cierto grado de conservación evolutiva. Esto podría deberse a que estas modificaciones tienen un papel mas bien estructural. En el caso de las fosforilaciones se deberia esperar un resultado similar. Sin embargo se encontraron fosfori lados sólo los ribosomas de cioroplastos y no los ribosomas de E. coli. Se podria especular entonces que las fosforilaciones de las proteinas ribosomales, que han sido descritas sólo en eucariontes, aparecieron en el cloroplasto con posterior i dad a su origen.

The ribosomes synthesize al1 the proteins in the cell. Therefore, they are present in all kind of organi sms and have the same role. Due to this, they are an excellent material for evolutive studies. In piants and certain protozoa, three types of ribosomes have been described: cytoplasmic, chloroplastic and mitochondrial. Analyzing the 165 ribosomal RNA from various organ i sms and according to several other criteria, Woese proposed a classification postulating three living groups: archebacteria, eubacteria and eukaryotes. They would have a common ancestor called progenote. Interestingly, this classification supports the hypothesis of an endosimbiotic origin for the chloroplast and mitochondria. As ribosomes have a similar function in the three types of organisms, the components of the particles should be preserved. According to this, the post-synthetical modifications of the ribosomal components such as methylation and phosphorylation, should also be conserved. Our 1 aboratory has recently demonstrated that the ribosomal protein methylation is highly conserved in eubacteria, showing a typical methylation pattern. Many of these methylated proteins have an important role in ribosome function. Taking into account these findings and considering the hypothesis of an endosimbiotic origin for the chloroplast, we have extended our studies of the modification of the proteins from the translational apparatus in or den to establish if chloroplastic ribosomes show methylation and/or phosphorylation of their proteins, and if these modifications show a pattern similar to the one found for eubacteria. The in vivo methylation of the ribosomes from E. gracilis was studied by growing the cells in the presence of (3H-methyl)methionine and (1-14C>methionine. Ri bosoma1 proteins were then obtained from either chloroplast or cytoplasmatic ribosomes by conventional methods. The ribosomal proteins were then analyzed by two-dimensiona.1 polyacrilamide gel electrophoresis. The degree of methylation was determined by measuring the 3H/14C ratio for each protein. We found that chloroplast ribosomes showed a distribution of methylated proteins in two-dimensional ge ls similar to that shown by prokaryotes. To confirm this, we also analyzed the methylated aminoacids present in the total ribosomal proteins. We found similar amounts of Lys(Me3) anp Lys(Me) in both chloroplast and E. coli ribosomes. On the other hand, the cytoplasmatic r i bosomes showed different amounts of each methylated aminoacid. These results suggest a certain degree of conservation of the methylation pattern since this one was similar in both the chloroplastic an the eubacterial ri bosomes. The in vivo phosphorylation of the ribosomal proteins from E. gracilis was studied by growing the cells in the presence of (32p)ortophosphate. Under these conditions, only two phosphorylated proteins where detected in chloroplast ribosomes and five in the cytoplasmic ribosomes. The phosphorylated residues found in both types of ribosomes were serine and threonine with a threonine/serine ratio of 1,9 for chloroplastic ribosomes and 1,1 for the cytoplasmatic ribosomes. In conclusion, the study of these post-synthetic modications of ribosomal proteins from bacteria and chloroplasts together with previous work already published by other groups suggest that the methylation of the translational apparatus shows a certain degree of evolutionary conservation. A similar situation was expected for the phosphorylation of ribosomal proteins. However, only the chioroplast ribosomes where phosphorylated when compared with the E. coli ribosomes. One could assume that the ribosomal protein phophorylations, which have been described in eukaryotes only, appeared after the organelle origin.