Identificación de factores de transcripción capaces de transactivar al promotor del gen PSY2 de D. carota

Abstract

Los carotenoides son compuestos isoprenoides sintetizados por organismos fotosintéticos y por algunos no fotosintéticos. Uno de los mecanismos más importantes en la regulación de la síntesis de carotenoides en plantas es la regulación a nivel transcripcional, la cual puede ocurmir en respuesta a luz y a hormonas, como el ácido abscísico. Esta fitohormona es sintetizada en el citoplasma a partir de la ruta de los carotenoides, y se encuentra involucrada en importantes procesos del desarrollo de plantas, además de mediar la respuesta a estrés abiótico. La mayoría de los genes regulados por ABA contienen elementos de respuesta a ABA (ABRE), de secuencia ACGTGG/TC, en sus promotores, la cual es reconocida por factores de transcripción del tipo bZIP. En particular los miembros de la subfamilia A de A. thaliana, denominada AREB/ABF, han mostrado unirse a motivos ABRE in vitro y activar la expresión génica dependiente de ABA. En Daucus carota, nuestro modelo de estudio, se ha demostrado que eli promotor del gen PSY2 es capaz de responder a ABA. PSY2 codifica para la enzima fitoeno sintasa (PSY) y que es considerada el primer paso limitante de la ruta de síntesis de carotenoides. El análisis bioinformático de este promotor reveló la existencia de 3 motivos ABRE, de los cuales 2 se encuentran próximos entre sí. También se encontraron 11 sitios de unión para factores de transcripción Alfin, los cuales están involucrados en procesos como el desarrollo de la raíz, la elongación de pelos radiculares y la regulación de la tolerancia a estrés por sal. Mediante el alineamiento entre el transcriptoma de D. carota y la base de datos de factores de transcripción PlantTFDB, en este trabajo se identificaron 5 secuencias con homología a factores de transcripción de la subfamilia AREB/ABF (ABRE1-5) y 3 а la familia Alfin (Alfin1-3). Los 5 factores de transcripción ABRE poseen el dominio característico de la familia de factores de transcripción bZIP, mientras que los tres factores de transcripción Alfin poseen los dominios DUF3594 y PHD. La infiltración de hojas de tabaco y la transfección de protoplastos de D. carota permitió determinar que todas las proteínas analizadas localizan en el núcleo, a excepción de Alfin2 que además posee localización citoplasmática. Mediante un ensayo de mono-híbrido en levadura se determinó que los factores de transcripción ABRE y Alfin analizados transactivan al promotor del gen PSY2 de D. carota. Sin embargo, los factores de transcripción CAREB1 y CAREB2, los cuales se unen a motivos ABRE del promotor del gen Dc3 demostraron no ser capaces transactivar al promotor de PSY2. El trabajo realizado permitió encontrar en D. carota factores de transcripción pertenecientes a la familia de factores de transcripción AREB/ABF y Alfin capaces de transactivar al promotor del gen carotenogénico PSY2 de D. carota.

Carotenoids are isoprenoids compounds synthesized by photosynthetic and some non-photosynthetic organisms. One of the most important regulation mechanisms of the carotenoid synthesis is the regulation at the transcriptional level, which can occur in response to light and hormones, like abscisic acid (ABA). This fitohormone is synthesized in the cytoplasm through the carotenoid pathway, and is involved in important plant development processes, and in mediating abiotic stress response. Most of ABA-regulated gene promoters contain ACGTGG/TC motifs, denominated ABA responsive elements (ABRE), which is recognized by bZIP transcription factors. Particularly the members of the subfamily A of A. thaliana AREB/ABF have shown to bind to ABRE in vitro and activate the ABA-dependent gene expression. In Daucus carota, our study model, it was demonstrated that the PSY2 gene promoter is able to respond to ABA. PSY2 gene encodes the enzyme phytoene synthase, the first committed step in the carotenoid biosynthesis pathway. Bioinformatic analysis of this promoter showed the presence of 3 ABRE, of which 2 are close to each other. Furthermore, 11 Alfin transcription factor binding sites were found, which are involved in processes such as root development, root hair elongation, and regulation of salt stress tolerance. Through the alignment between the transcriptome of D. carota and the data base of transcription factors PlantTFDB, in this work we identified 5 sequences with homology to the subfamily of transcription factors AREB/ABF (ABRE1-5) and 3 to the Alfin family (Alfin1-3). All ABRE transcription factors showed to contain the characteristic domain of of the bZIP transcription factors family, while the three Alfin transcription factor showed to contain the DYF3594 and PHD domains. The infiltration of tobacco leaves and transfection of D. carota protoplasts allowed to determine that all proteins localized in the nucleus, except for Alfin2 which also has a cytoplasmic localization. Using a yeast one-hybrid assay we found that the ABRE and Alfin transcription factors analyzed transactivate the D. carota PSY2 promoter. However, the transcription factors CAREB1 and CAREB2, which bind to ABRE present in the carrot Dc3 gene promoter, were not able to transactivate the PSY2 promoter. This work allowed to find in D. carota transcription factors with homology to the AREB/ABF and Alfin transcription factors family which can transactivate the promoter of D. carota PSY2 gene.