Estudio sobre los posibles mecanismos que evitan la autorrestricción del DNA cromosomal en bacterias

Abstract

Durante el subclonamiento en Escherichia coli de los genes bstVIRM de Bacillus stearothermophilus V, se obtuvo clones cuyo fenotipo es r+ m-. Dado que la DNA metil transferasa protege normalmente el DNA cromosomal de la autorestricción, se estudió la posibilidad que mecanismos alternativos a la metilación del DNA pudiesen explicar su viabilidad celular. Se analizó dos hipótesis: la existencia de un inhibidor de la endonucleasa, y una compartamentalización celular de la enzima. Estudios de fraccionamiento de extractos celulares y marcación diferencial de proteínas, permitieron descartar la primera posibilidad. Al analizar la segunda alternativa, se demostró la presencia de BstVI mayoritariamente en el citosol (92% del total de la actividad), lo que también descartó esta probabilidad como responsable de la viabilidad de los clones mencionados. Experimentos de restricción in vivo por otro lado, demostraron que la enzima BstVI es pobremente funcional en E. coli. Probablemente entonces, la viabilidad de los clones r+m- podría ser consecuencia de al menos dos eventos diferentes, una actividad parcial de BstVI a 37°C y la participación de los sistemas de reparación propios del huésped. Un análisis similar en el huésped homólogo no ha sido posible debido a la carencia de mutantes. Sin embargo, se analizó la expresión de ambos genes durante el ciclo de crecimiento de la bacteria. Ensayos de actividad y experimentos de transferencia "Northern", permitieron concluír que la expresión de ellos disminuye simultáneamente al iniciarse la esporulación.

When the bstVIRM genes from Bacillus stearothermophilus V were subcloned into Escherichia coli, clones exhibiting the r+m- phenotype were obtained. Since the DNA methyl transferase normally protects the host chromosome from restriction, the possibility that mechanisms alternative to DNA methylation could explain the viability of these clones was investigated. Two possibilities were considered: the existence of a BstVI inhibitor and the cellular compartmentation of the endonuclease. Fractionation of cell-free extracts and differential labeling of proteins, discarded the first possibility. Regarding the second, it was determined that the enzyme was present mainly in the cytosolic fraction (92% of the total activity), indicating that this was also not the answer. On the other hand, in vivo restriction experiments showed that BstVI restriction endonuclease is poorly functional in E. coli. Probably then, the viability of r+m- clones could be a consequence of at least two different events: a partial activity of the enzyme at 37°C and the participation of the repair mechanisms of the host. Similar studies in the homologous host have been hampered because of the lack of mutants. However, the expression of both, bstVIM and bstVIR genes was analyzed during sporulation. Determination of enzyme activities and Northern analysis demonstrated that the expression of the whole system is reduced at the onset of the sporulative process.