Calicreina glandular en plasma : estudios de los niveles circulantes y su relación con la función renal

Abstract

Con el propósito de clarificar el papel que pueda tener el sistema calicreína-cininas de origen glandular en la regu lación de la presión arterial es necesario establecer la pre sencia de calicreína activa en la sangre y medir sus variacio nes frente a estímulos fisiológicos. Con este objetivo desarrollamos un método que nos permitió separar y medir específicamente la enzima a partir del plasma de rata. La sangre obtenida de la arteria carótida en tubos plás ticos citratados, fue centrifugada a 1.500 g x 15 min a 4° C y el plasma tratado con Polybrene (5 ugr/ml) a fin de evitar la activación de la calicreína plasmâtica. El plasma fue sometido a fraccionamiento con sulfato de amonio (30- 70%) para eliminar proteínas de alto peso molecular. El precipitado fue resuspendido y cromatografiado en una columna de afinidad Sefarosa - Aprotinina. El material adsorbido fue lavado con tampốn TRIS-HC1 0,1 M, 0,2 M NaC1 pH = 8,1. La enzima se eluyő con un inhibidor competitivo p-aminobenzamina 50 mM. El análisis electroforético de este material purificado en gel de poliacrilamida alcalina mostró microheterogeneidad, apareciendo dos bandas muy cercanas con un sólo pico de actividad, al igual de lo observado para la calicreína urinaria usada como estandar. E1 material plasmático obtenido se comporta como calicreína glandular porque posee actividad enzimática sobre el cininő geno de bajo peso molecular obtenido de plasma de rata; hidroliza el sustrato sintético específico S - 2266 у porque ambas actividades enzimáticas son inhibidas por aprotinina, benzamidina y por anticuerpos anticalicreína urinaria de rata. Con el fin de validar nuestro método para separar cali creína glandular del plasma y de estudiar la participación del riñőn en la entrega de esta enzima al plasma, cuantificamos sus variaciones frente a estímulos agudos y cronicos que comprometen la función renal. Cuatro grupos de ratas fueron sometidas a las siguientes manipulaciones experimentales: nefrectomía bilateral 24 horas antes de ser sangra - das; ligadura bilateral de uréteres 24 horas antes de ser sangradas; alimentación con dieta hiposódica por 1 y 2 semanas antes de ser sangradas; hipertensión experimental Goldblatt 1 pinza- 1 riñón. Los animales fueron sangra dos 7 semanas después del pinzamiento de la arteria renal. Los valores de la actividad cininogenásica de la calicreína glandular contenida en el plasma y de la calicreína uri naria de los grupos experimentales fueron comparados con aquellos de los controles con operación ficticia o con dieta normosődica. La actividad enzimática fue medida mediante RIA y/o bioensayo para cininas. En los animales con 24 horas de nefrectomía total los valores de calicreína activa en el plasma se duplicaron (p <0,001), mientras que en los animales con ligadura de uréteres y riñones "in situ" disminuyeron significativamente (p < 0,001). La dieta hiposődica produjo un aumento significativo tanto en los valores de calicreína urinaria como de calicreína glandular en el plasma, con una correlación significativa entre ambos. En la fase crónica de la hipertensión experimental Goldblatt 1 pinza 1 riñón hubo disminución significativa de la calicreína urinaria, confirmándose hallazgos anteriores; no se observó sin embargo, cambio alguno en el contenido de calicreína glandular en el plasma de estos mismos animales. Podemos concluir: 1.- El método que hemos desarrollado permite cuantificar calicreína glandular biológicamente activa en el plasma y cuantificar sus variaciones. 2.- La presencia de calicreína glandular en el plasma permite postular que el Sistema Calicreína-Cininas además de su papel fisiológico local puede desempeñar funciones de regulación sistémica. 3.- Los resultados obtenidos al modificar parámetros de función renal indican que el riñón participa en la en trega de calicreína a la circulación, pero que no es la única y tal vez tampoco la principal fuente de ella.

To clarify the rol of glandular kallikrein-kinin system in arterial pressure regulation we have developed a method to measure active glandular kallikrein in blood and its va riations in response to physiological changes. Blood was collected in plastic tubes with sodium citrate, and centrifuged at 1.500 x g for 15 min at 4° C. The plasma was treated with Polybrene (5 ug/ml) and fractionated with ammonium sulfate (30- 70 %) to eliminate high molecular weight proteins. The second precipitate was resuspended and applied to a column of Sepharose-Aprotinin. The adsorbed ma terial was washed with buffer TRIS-HCI1 0,1 M, NaCl, pH = 8,1 and eluted with p-aminobenzamidine 50 mM, a competitive inhi bitor of kallikrein. The eluted material showed microheterogeneity, exhibi - ting two protein bands with only one peak of activity which corresponds to purified standard urinary kallikrein. This material behaves as glandular kallikrein. In fact, it shows enzymatic activity against the low molecular weight kininogen and hydrolizes the S-2266 synthetic sustrate which is also suitable for glandular kallikrein. Both enzymatic activities are inhibited by aprotinin, benzamidine and by rat urinary kallikrein antibodies. In order to evaluate the method and to study the kidney involvement in plasma glandular kallikrein variations, the. enzyme in blood before and after acute chronic changes in re nal function was measured. Four groups of rats were submitted to different experimental maneuvers: bilateral nephrecto my or bilateral ureteral obstruction 24 hours before bleeding, low sodium diet for 1 or 2 weeks before bleeding, and rats with Goldblatt 1 clip -1 kidney experimental hyperten sion. Hypertensive animals were bled 7 weeks after renal artery clipping. The kininogenase activity of glandular kal likrein purified from plasma of experimental and control rats was measured by RIA and/or bioassay for kinins. In nephrectomized rats the amount of active glandular kallikrein in plasma was two fold (P < 0,001) while in rats with ureteral obstruction it was significantly lower (p < 0,001) than in control rats. The low sodium diet induced a significant increase in both, urinary and plasma glandular kallikrein, with a significant correlation between these values. In chronic Goldblatt 1 clip - 1 kidney exреrimental hypertension, as previously described, a signifi - cant decrease in urinary kallikrein was found, however, no changes were observed in plasma glandular kallikrein. In conclusion: 1.- We have developed a method that allow us to measure ac tive glandular kallikrein in blood. 2.- The occurrence of glandular kallikrein in blood lead us to postulate that kallikrein-kinin system could have a systemic function in blood pressure regulation. 3.- The observed data in response to changes in renal function suggest that although the kidney may contribute with kallikrein to the circulation, glandular kallikrein in plasma derives also from kallikrein sources other than the kidney.