Desarrollo del fenotipo neuroquímico y de la morfología de los terminales axónicos del núcleo Isthmi pars parvocellularis (Ipc) en Gallus gallus

Abstract

En vertebrados existen dos vías visuales principales, la vía tálamo-fugal y la vía tecto-fugal. En esta última, la más desarrollada en aves, el tectum óptico (TeO, colículo superior en mamíferos) es el blanco primario de las proyecciones retinianas. El TeO se conecta topográfica y recíprocamente con los núcleos del complejo del istmo conocidos como istmo parvocelular (Ipc), istmo magnocelular (Imc), e istmo semilunaris (SLu). En particular, el núcleo Ipc devuelve una retroalimentación visual sobre el tectum que determina la transmisión de las señales visuales retinianas hacia centros superiores. En aves y otros vertebrados, Ipc se considera un núcleo colinérgico debido a la expresión de la enzima colin-acetil-transferasa (ChAT) en sus neuronas y terminales axónicos. Sin embargo, resultados recientes muestran en Ipc de individuos adultos la ausencia del RNA mensajero del transportador vesicular de acetilcolina (VAChT) y la presencia del RNA mensajero de transportador vesicular de glutamato 2 (VGLUT2), lo que sugiere que este núcleo liberaría glutamato en lugar de acetilcolina. En este trabajo, con el fin de determinar si durante el desarrollo existe un cambio en la expresión de estos marcadores en Ipc, y por tanto, una modificación en su fenotipo neuroquímico, se revisó mediante ensayos de inmunohistoquímica e hibridación in situ el desarrollo del patrón de expresión de los marcadores colinérgicos ChAT, CHT y VAChT, y los glutamatérgicos VGLUT2 у VGLUT3 (transportador vesicular de glutamato 3). Además, dado que la actividad neuronal y la liberación de neurotransmisores han sido relacionados con el desarrollo de arborizaciones axonales y proyecciones topográficas, es que en este trabajo se evaluó en diferentes estadíos embrionarios el desarrollo de las arborizaciones axónicas de Ipc mediante el uso de un trazador neuronal. Los resultados mostraron que entre E12 y E16, el núcleo Ipc expresó los RNA mensajeros colinérgicos ChAT, CHT y VAChT y el glutamatérgico VGLUT2, apoyando así, un fenotipo tanto colinérgico como glutamatérgico para Ipc en esta ventana embrionaria. A partir de E18 las células de Ipc continuaron expresando ChAT, CHT y VGLUT2, sin embargo, la expresión de VAChT disminuyó hasta niveles casi indetectables, sugiriendo que desde este estadío y hasta individuos adultos, este núcleo presentaría una neuroquímica principalmente glutamatérgica. Por otro lado, tanto en los estadíos embrionarios como postnatales, el núcleo SLu exhibió un patrón de expresión de marcadores colinérgicos y glutamatérgicos concordante con su reconocido fenotipoо colinérgico, mientras que la ausencia de expresión de estos marcadores en el núcleo Imc, concuerda con el fenotipo GABAérgico descrito para éste en adultos. Con respecto a la morfología de los axones de Ipc, en E13 se identificaron axones carentes de ramificaciones, extendiéndose hasta capas intermedias del TeO. En E15 los axones presentaron una clara expansión del campo de ramificaciones terminales. Finalmente, en E18, se observaron terminales en forma de pincel con su característico patrón de arborización observado en individuos postnatales. Estos resultados apoyan la idea de que en un primer periodo embrionario las células del núcleo Ipc podrían liberar vesicularmente tanto acetilcolina como glutamato. Posteriormente a ese período inicial y hasta la adultez, la liberación se restringiría principalmente a glutamato. Por otro lado, los terminales axónicos de Ipc presentarían un desarrollo temprano, en donde la maduración de sus terminales estaría completa un par de días previo a la eclosión. Interesantemente, el hecho de que la posible соliberación de neurotransmisores y la maduración de terminales de Ipc ocurran en el mismo periodo embrionario, sugeriría una correlación funcional entre ambos eventos.

In vertebrates there are two main visual pathways, the thalamo-fugal and tectofugal pathways. In the latter, the most developed in birds, the optic tectum (TeO, superior colliculus in mammals) is the primary target of retinal projections. The TeO is connected topographically and reciprocally with the nuclei of the isthmic complex, constituted by the nuclei isthmi pars parvocellularis (Ipc), isthmi pars magnocellularis (Imc), and isthmi pars semilunaris (SLu). In particular, the Ipc nucleus sends a visual feedback to the TeO which controls the transmission of retinal visual signals to higher visual centers. In birds and other vertebrates, Ipc is considered a cholinergic nucleus because its neurons and axonal endings express the choline acetyl transferase enzyme (ChAT). However, recent results show that Ipc neurons of adult individuals express the messenger RNA of the vesicular glutamate transporter 2 (VGLUT2) and not the messenger RNA of the vesicular acetylcholine transporter (VAChT), suggesting that the Ipc cells would be able to release glutamate instead of acetylcholine. In this study, in order to explore whether there is a change in the expression pattern of these markers in Ipc during development, and thus a neurochemical phenotype modification, we analyzed by immunohistochemical and in situ hybridization assays, the expression of the the messenger RNA of the cholinergic markers ChAT, VAChT and CHT, and of the glutamatergic markers VGLUT2 and VGLUT3 (vesicular glutamate transporter 3) at different embrionic stages. Furthermore, since in general the neural activity and the release of neurotransmitters have been implicated in the development of both the axonal arborization and the topographic projections of neurons, we also evaluated the development of Ipc axonal arborization using neuronal tracers. The results showed that between E12 and E16, the Ipc nucleus showed a strong expression of the mRNAs of all cholinergic markers, ChAT, CHT and VAChT, and also of the VGLUT2 mRNA, supporting a dual cholinergic and glutamatergic phenotype for Ipc during this embryonic period. From E18 onwards, the Ipc cells continued expressing ChAT, CHT and VGLUT2 mRNAs, but VAChT mRNAs expression decreased to almost undetectable levels, suggesting that from this stage this nucleus mainly presents a glutamatergic phenotype. On the other hand, in both embryonic and postnatal stages, the Slu nucleus exhibited a cholinergic and glutamatergic expression pattern consistent with its recognized cholinergic phenotype. At the same time the absence of expression of these markers in the Imc nucleus is consistent with the GABAergic phenotype described for this nucleus in adults. Concerning the morphology of Ipc axons, at E13, we identified axons lacking of terminal branches and extending to intermdiate tectal layers. At E15 their axons showed a clear expansion of the field of terminal branches. Finally, At E18 we identified Ipc axon terminals with their typical pattern of arborization observed at adult stages. These results support the idea that at early embryonic stages, the Ipc cells would be able to release both acetylcholine and glutamate by a vesicular mechanism. Following this initial period and until the adulthood, the neurotransmitter release would be mainly restricted to glutamate. Moreover, the Ipc axonal endings present an early development, such that the maturation of their axonal endings would be completed a few days before hatching. Interestingly, the coincidence of the embryonic stages at which the presumptive co-release of neurotransmitters and the maturation of Ipc axonal endings take place, would suggest a functional relationship between these two events.