Especificidad de huésped y variabilidad genética de cepas de Frankia aisladas de nódulos radiculares de las plantas de la familia Rhamnaceae, detectada mediante análisis de marcadores moleculares RAPDs y PCR-RFL

Abstract

Frankia es un microsimbionte que induce la formación de nódulos radiculares en un gran número de plantas no leguminosas que habitan múltiples ambientes. En Chile, Frankia está asociada a 5 géneros de plantas actinorrícicas de la familia Rhamnaceae: Colletia, Trevoa, Talguenea, Discaria, y Retanilla. Estudios previos en los que se ha utilizado cepas de esta familia de plantas reveló que estas cepas están estrechamente relacionadas, mostrando similitud tanto en sus caracteres fenotípicos.como a nivel de secuencia del 16S rDNA. En este estudio se propоnе conocer acerca de la extensión de la diversidad genética del microsimbionte aislado de plantas de Rhamnaceas, y también determinar su rango de huésped. Para esto, las cepas se caracterizaron utilizando marcadores moleculares como RAPDs y PCR-RFLP de las regiones intergénicas entre los genes nifD-nifK y 16S-23S. Para los marcadores RAPD se probaron un grupo de partidores de los cuales se seleccionaron aquellos que mostraron gran poder de discriminación con todas las cepas. Se obtuvieron 51 bandas las cuales se analizaron para su presencia y ausencia, y luego se calculó el coeficiente de similaridad entre las cepas. El dendrograma obtenido muestra bajos valores de similitud entre las cepas y se puede distinguir entre ellas de acuerdo a los patrones RAPD. Además, todas las cepas se caracterizaron por marcadores RFLP utilizando diferentes enzimas de restricción. Las secuencias blanco para estos marcadores fueron fragmentos amplificados de dos regiones intergénicas entre los genes ribosomales 16S23S, y entre los genes nifD-nifK. Este análisis se realizó utilizando 61 y 45 bandas respectivamente, el cual mostró una buena discriminación entre las cepas. Aunque algunas cepas comparten el mismo patrón de bandeo para muchas enzimas de restricción, cuando ellos son combinados los patrones son mas distintivos para cada una de las cepas. Estos marcadores moleculares establecen relaciones de similitud entre cepas derivadas de una familia de plantas como también de las que son aisladas de diferentes familias. El dendograma obtenido para la región 16S-23S agrupa todas las cepas aisladas de rhamnaceas en un cluster con un nodo por encima de 30% de similitud. Cuando se utiliza la región entre nifD-nifK, las cepas que provienen de rhamnaceas se agrupan con valores por encima de 40% de similitud. También puede verse que dos cepas, TH11 y Tl42, aisladas de Trevoa trinervis comparten los mismos haplotipos para 4 de las enzimas utilizadas. Las cepas de otras familias generalmente caen fuera del cluster de la familia Rhamnaceae. Las cepas de Frankia se probaron en plantas pertenecientes a 4 grupos de especificidad de huésped: Trevoa trinervis (Rhamnaceae), Elacagnus angustifolia (Elaeagnaceae), Alnus glutinosa (Betulaceae), y Casuarina cunninghamiana (Casuarinaceae). Todas las cepas aisladas de la familia Rhamanceae fueron capaces de nodular T. trinervis y E. angustifolia. Solamente una de ellas, ChI4 aislada de Colletia hystrix, fue infectiva en A. glutinosa. Estos resultados sugieren que las cepas de Frankia aisladas de Rhamanceae pertenecen a la subdivisión de infectividad de Elaeagnus definido para el género Frankia. Todos los nódulos inducidos por Frankia mostraron reducción de acetileno, indicando que el microsimbionte utilizado como inóculo fue efectivo en la fijación de nitrógeno. El efecto de la simbiosis actinorrícica en las plantas utilizadas se determinó utilizando los siguientes parámetros: altura del tallo, peso seco total, diámetro del tallo, y contenido total de nitrógeno. Todas las cepas aisladas de rhamnaceas tuvieron un efecto positivo en las plantas hospederas de T. trinervis y E. angustifolia. La identificación de los mejores pares simbióticos (Cepa-planta) es esencial para la evaluación de posibles usos de esta simbiosis en estrategias de recuperación de suelos.

Frankia is a nitrogen fixing microsymbiont that induces root nodules with a large number of non-leguminous plants that inhabit various environments. In Chile, Frankia is associated with five genera of actinorhizal plants from Rhamnaceae family: Colletia, Trevoa, Talguenea, Discaria, and Retanilla. Previous studies using Frankia strains from these actinorhizal plants showed that these strains are closely related showing the same phenotypic features and 16S rDNA sequence. In this approach, it is proposed to know about genetic diversity extension of microsymbiont isolated from Rhamnaceae family plants and determine their host range. For that, strains were characterized using molecular markers like RAPDs and PCR-RFLP of intergenic regions between nifD-nifK and 16S-23S ribosomal genes. For RAPD markers a set of primers were probed and three of them were selected based on their amplification power with all strains. Fifty one bands were obtained, which were analyzed for their presence or absence, and then similarity coefficients were calculated among strains. The dendrogram obtained showed low values of similarity among strains that can be distinguished from eachother on the basis of RAPD marker profiles. In addition, all strains were characterized through RFLP markers using different restriction enzymes. Target sequences for these markers were amplified fragments of two intergenic regions between 16S and 23S ribosomal genes, and between nifD-nifK genes. This analysis was done on basis of sixty one and forty five restriction fragments respectively, and showed a good discrimination among strains. Although some strains share some banding pattern (haplotypes) to a restriction enzyme, when several of them are combined, fingerprinting becomes more distinctive for each strain. These molecular markers establish similarity relationships between strains derived from a plant family as well as strains isolated from different family plants. The dendrogram obtained from 16S23S RFLP, group all strains derived from rhamnal plants in a cluster with a node up to 30% of similarity. When nifD-nifK RFLP is used, strains that come from Rhamnaceae family are grouped with values up to 40% of similarity. It also can be seen that two strains, Tt142 and Tl11, taken out from Trevoa trinervis share the same haplotypes in four of the enzymes assayed. Strains from other families fell down generally out of the Rhamnaceae cluster. The Frankia strains were tested on host plants belonging to the four host specificity groups: Trevoa trinervis (Rhamnaceae), Elaeagnus angustifolia (Elaeagnaceae), Alnus glutinosa (Betulaceae), and Casuarina cunninghamianа (Casuarinaceae). All strains isolated from Rhamnaceae were able to nodulate T. Trinervis and E. angustifolia. Only one of them, ChI4 isolated from Colletia hystrix, was also infective on A. glutinosa. These results suggest that Frankia strains from Rhmnaceae belong to the Elaeagnus infective subdivision defined to Frankia genus. All Frankia-induced nodules showed a positive acetylene reduction, indicating that the microsymbionts used asThe effect of actinorhizal symbiosis on the tested plants was determined by following parameters: shoot height, total dry weight, stem diameter, and total nitrogen content. All strains isolated from Rhamnaceae had a positive effect on the host plants T. trinervis and E. angustifolia. The identification of the best Frankia- Atinorhizal plant symbiotic pairs is essential to evaluate the potential use of this symbiosis for land reclamation strategies. inoculants were effective in nitrogen fixation.