Estudio inmunológico de membranas de túbulos transversales aisladas de músculo estriado de rana

Abstract

Anticuerpos monoclonales -obtenidos utilizando como inmunógeno una preparación de membrana enriquecida en túbulos transversales de músculo esquelético de rana, se usaron en esta tesis por un lado para confirmer el origen y contribuir a la determineción de la pureza de las preparaciones de membranas de túbulo transversal y de membrana de superficie de músculo de rana y, por otro, para-ser-usados como sondes bioquímicas en el estudio estructural y funcional de un componente especifico de estas membranas. Se preparó una serie de anticuerpos monocionales mediante la fusión de células esplénicas de un ratón BALB/C, inmunizado con una preparación de túbulos transversales de músculo esquelético de rana y célules de mielome de le linea NSO/2. Los anticuerpos se analizaron por ELISA contra les distintas preparaciones de membranas. Siete células que cumplían el criterio de análisis, se clonaron por dilución límite y se inyectaron en la cavidad peritoneal de ratones BALB/C, previamente tratados con Pristano para- inducir la formación de tumores escíticos, fuente de una gran cantidad de anticuerpos. Luego, las células se congelaron en nitrógeno líquido. De estas siete lineas celulares, dos no presentaron reactividad con las prepareciones de membranas luego de clonadas, y cinco presentaron una unión preferencial en ELISA con le preperación de túbulos transversales y une baja reactivided con la preparación de retículo sarcoplesmático. La unión de los anticuerpos monoclonales anti túbulos transversales a preperaciones de membranes de músculo de rana es compatible con una baja contaminación de vesícules de túbulos transversales en la prepareación de retículo sarcoplasmático y con una conteminación significativa en la preperación de membrana de superficie. En experimentos de inmunofluorescencia usendo cortes de tejido de músculo esquelético de rana, estos anticuerpos presentaron patrones de fluorescencia asociados a la ubicación de la bande I, rica en túbulos transversales, y en el sarcolema. No se encontró fluorescencia a nivel de la banda A, rica en retículo sarcoplasmático. En experimentos de Inmunoblot, tres de los anticuerpos monoclonales reconocieron una proteína, de 107 KDa. Esta proteina se identificó posteriormente como la enzime Mg+2ATPasa sobre la base de la modulación de la activided de hidrolítica de la enzima por dos de los anticuerpos. Uno de estos anticuerpos, el 2/34.4, indujo una activación de la enzime de hasta cinco veces, en forma similer a como lo hacen algunas lectinas. Estos anticuerpos, en especial- el 2/34.4,- serian especialmente útiles tanto para el estudio del mecanismo y la función fisiológica de esta enzima, como pera la identificación de membranas de túbulos transversales.

Monocionál antibodies raised against transverse tubule membranes were used both to evaluate the origin and purity of frog muscle membranes preperations isoleted by conventional biochemicals methods, and to study the structural and function of a specific macromolecular component of the transverse tubule membranes. Starting with an antigenic membrane fraction enriched in frog muscle transverse tubules, several monoclonal entibodies were produced by fusion of spleen cells from an inmunized BALB/C mouse with NSO/2 mouse myeloma cells. Antibodies were screened according to the reactivity with membrane fractions isolated from frog skeletal muscle. Seven cell lines, that fulfilled the screening criteria were cloned by limited dilution, were injected in the peritoneal cavity of BALB/C mouse to induce an ascitic tumor, rich in antibodies and were frozen in liquid nitrogen. Of the seven antibodies, two did not present reactivity after cloning by limiting dilution, and the other five presented preferential binding to the transverse tubule membrane fractions using ELISA and a minimal binding to sarcoplasmic reticulum membrane fractions. The binding of the monoclonal antibodies anti transverse tubules membranes allows us to detect a very low level of contamination with transverse tubules in the sarcoplasmic reticulum enriched membrane fraction and a significant conteminetion of T-tubules origin in the surface membrane enriched membrane fraction. In inmunofluorescent experiments with cryostatic sections of frog muscle tissue these antibodies elicit fluorescense patterns associated with the I band, rich in transverse tubules and no fluorescense in the A band, rich in sercoplasmic reticulum. In Innmunoblot experiments three of the antibodies recognized one protein; one with a moleculer weight of 107 KD. That was identified as the Mg+2ATPase. Some of the antibodies are eble to modulate the enzyme activity; 2/34.4 is capable of activeting this enzyme five-fold, as has been reported for some lectins. The antibodies raised in this study will be useful both for studying the mechenism and function of the Mg+2ATPese and for the identification of transverse tubule membranes.