Incorporación de leucina tritiada a calicreina en cortes de tejido renal

Abstract

En la hipertensión renovascular experimental modelo Gold blatt un riñón-una pinza (G1), se observa una disminución pre coz de la calicreina urinaria y del tejido renal, la que рodría estar relacionada a una alteración de la capacidad de síntesis de la enzima. Con el objeto de clarificar si esta alteración en la síntesis de calicreina está relacionada con el menor aporte de oxígeno a la corteza renal, originado por la reducción y la redistribución del flujo sanguíneo, debido al pinzamiento de la arteria, estudiamos la incorporación de leucina tritiada a la calicreina en cortes de tejido renal, incubados en atmósferas de 95% oxigeno y 95% aire. En la cuantificación e identificación de la enzima, uti lizamos técnicas de inmunoprecipitación, lo que hizo necesa rio obtener la fracción de inmunoglobulina G del suero de un conejo inmunizado con calicreina urinaria de rata (CUR). El suero fue fraccionado con sulfato de amonio al 50%, para eli minar proteínas de alto peso molecular. La fracción cruda de inmunoglobulinas se cromatografid en una columna de DEAEcelulosa, obteniéndose dos picos de proteinas; el primero, que contenía la mayor proporción de IgG, se eluyó con tampõn fosfato de sodio 0,01 M, pH 8,0. El segundo pico se eluyó con aumento de la fuerza iónica. Ambos picos de proteínas dieron reacción con CUR, usada como estandar en los ensayos de inmunodifusión, mostrando una linea única de precipitación. Sin embargo, se requiere de una mayor concentración proteíca, tanto en el ensayo de inmunoprecipitación como para lograr el 50% de la inhibición de la enzima, cuando se usa el segundo pico. La incorporación de leucina tritiada a calicreina se efectuó incubando cortes de tejido renal por 12 horas en un medio EAGLE con (3H)-3,4,5-L-leucina (6 uCi/ml) en una atmôsfera controlada de O2 y CO₂ a 37°C y pH 7,4. Finalizada la incubación los cortes de riñón se homogeneizaron y se centrifugaron a 20.000 x g durante 2 h. La calicreina pre sente en el material soluble se inmunoprecipitó utilizando los anticuerpos anti-CUR provenientes del primer pico de la columna de DEAE-celulosa, en una dilución de 1:6000. Como agentes coprecipitantes se utilizaron soluciones que contenían BSA-anti BSA al 0,2% y polietilén glicol al 25%. En el análisis electroforético en PAGE-SDS al 11%, este material precipitado mostrő un patrón de migración similar àl de cali _125+ creinа -+I usada como estandar. Con el objeto de estudiar la posible participación del menor aporte de oxígeno en la disminución de la excreción de la calicreina observada en la hipertensión G1, cuantificamos la incorporación de leucina a la enzima. Los estudios se realizaron en cortes de tejido renal provenientes de ani males hipertensos, incubados en atmósferas de 95% O₂ у 5% CO2 6 95% aire y 5% CO₂. Los riñones fueron obtenidos después de 8 semanas del pinzamiento de la arteria renal. Los valores de proteínas solubles totales y de calicreina de los grupos experimentales fueron comparados con aquellos de los controles con operación ficticia. La incorporaciốn de leucina a la calicreina en riñones de animales G1 fue un 32% menor que en los riñones control (p < 0,02), a una concentración de 95% O2 Y 58 CO2. En una atmősfera con 95% aire y 5% CO2, la diferencia fue de un 728 (p <0,01). Tambiên, la incorporación de (³H)-leu a protei nas solubles totales en riñones G1 fue menor que en riñones control: 24% inferior en una atmósfera con 95% oxígeno (p (0,001), y 62% del control en una atmósfera con 95% aire (p <0,001). Podemos concluir: 1. El método que hemos desarrollado, permite determinar la calicreina renal que incorpord el brazador "in vitro", y cuantificar sus cambloв. 2. Los resultados obtenidos al modificar la concentración de oxígeno en el medio de incubación, indican que la síntesis de calicreina éstaría afectada por la disminu ción del aporte de oxigeno a la zona cortical del riñốn, donde se encuentran las células que sintetizan calicrei na. 3. Para postular un efecto dirécto y especifico del oxígeno sobre la síntesis de la calicreina, sería necesario comparar la incorporacion de (³H)-leu a la calicreina, con la de una proteína con tasas de síntesis y degradaciốn similares a las de la calicreina.

In Goldblatt one clip-one kidney experimental hypertension G1, we can observe an early decrement of urinary kallikrein and renal tissue kallikrein, which could be associated to an alteration of the capacity to synthetize of the enzyme. With the idea to clarify whether this alteration in the kal - likrein synthesis is related to the lesser supply of oxygen. to the renal cortex, originated by the reduction and redistri bution of the blood flux, occasionated by the clipping of the artery, we studied the incorporation of (³H)-leucine to kallikrein in the renal tissue slice, incubated with 95 % oxygen and with 95 % air. To achieve this, we obtained the immuno - globulin G fraction from the serum of an immunized rabbit with rat urinary kallikrein (RUK) fractionated with a ammonium sul phate 50 %, to eliminate proteins of high molecular weight. The raw fraction of the immunoglobulins was applied to a co - lumn of DEAE-celulose, obtaining two protein peaks; the first one, that contained the biggest proportion of IgG was eluted with buffer sodium phosphate 0.01 M, pH 8.0. The second peak was eluted by an increase in the lonic force. Both protein peaks reacted to RUK, used as standard in immunodifusion assays, showing a unique line of precipitation. On the other hand, it is necessary a stronger protein concentration, not only in the immunoprecipitation assay, but also to obtain the 50 % of inhibition of the enzyme when using the second peak. The incorporation of (3H)-leucine to kallikrein was de veloped by incubating renal tissues slices for twelve hours in an EAGLE with (³11) - 3, 4,5-L - leu (6 uCi/ml) medium in a controlled atmosphere of 02 y CO2 at 37°C and pH 7.4. After the incubation, renal slices were homogenized in the cultured medium, previous addition of desoxicolate of sodium (0.5 % w/v) and benzamidine (0.05 M) and were centrifuged at 20.000 x g for two h. The kallikrein present in the soluble material was immunoprecipitated by using the antibodies antiRUK from the first peak of the DEAE-cellulose column in a dilution of 1/6000. As coprecipitating agents we used solutions that had BSABSA to 0.2 % and Polyetilen glicol at 25 %. In PAGE-SDS at 11%, this precipitated showed a migration pat125 tern similar to one for kallikrein -tI, used as standard. With the idea to study the possible role of the lesser supply of O2 in the disminution of urinary kalllkrein exeretion in G1 hypertension, we quantificated the incorporation of (³H)-leucine to the enzyme in slice of renal tissue from hypertensive animals, incubated in an atmosphere of 95 % 02 and 5 % CO2 or 95 % air and 5 % CO2. The kidneys were obtained after eight weeks of clipping the renal artery. The values of

total soluble proteins and kallikreins from the experimental groups were compared to the control sham operated. The incorporation of (3H)-leucine to kallikrein in the kidneys of G1 animals was 32 % lower than in control kidneys (p < 0.02) to a concentration of 95 % 02 and 5 % CO₂. In an atmosphere with 95 % air and 5 % CO2, the difference was 72% (p<0.001). Also the incorporation of (³11) leu to total soluble proteins in Gl kidneys was lower than in control kid neys, 24 % with 95 % oxygen (p (0.001) and 62 % with 95 % air (p 0.001).

As conclusions we can say: 1.- The method developed allows us to determine the "in vi tro" synthetized kallikrein and quantify its variations. 2.- The results obtained when the oxygen concentration was modified, show that the kallikrein synthesis is altered by a disminution of the oxygen delivery to the renal cortex, where cells that synthetize kallikrein are found. 3.- To postulate the direct and specific effect of the оxygen on the kallikrein synthesis, it would be necessary to compare the incorporation of (3H) leu to the kal - likrein, with the incorporation to another protein having synthesis and degradation rates similar to kallikrein.