Interacción de bacterias que degradan policlorobifenilos (PCBs) con sustratos hidrofóbicos : papel de la quimiotaxis y la presencia de proteinas en el medio extracelular

Abstract

La liberación de contaminantes ambientales, principalmente por industrias, causa varios problemas asociados a la salud humana y un severo daño a la biósfera. De las variadas estrategias que se han utilizado para resolver este problema ambiental, la solución mediante el uso de bacterias degradadoras de contaminantes ambientales (biorremediación) es una alternativa eficiente y menos costosa en comparación a otros métodos. La mayoría de los avances que se han logrado en los últimos 25 años respecto al tema de la biorremediación se han enfocado principalmente en caracterizar tanto a nivel genético como enzimático muchas de las cepas aisladas de suelos contaminados. Los policlorobifenilos (PCBs) son compuestos organoclorados que han sido catalogados como uno de los principales contaminantes medioambientales. Muchos microorganismos son capaces de transformar algunos PCBs a unidades más sencillas е inocuas utilizando rutas metabólicas especiales. Entre estos se encuentran las bacterias Gram-negativas Pseudomonas sp. B4 y Burkholderia xenovorans LB400, las que pueden transformar y, en algunos casos, usar algunos PCBs como únicas fuentes de carbono y energía. La vía metabólica que transforma los PCBs se identificó en B. xenovorans LB400, lográndose aislar y clonar el locus bph responsable de la degradación de estos compuestos. Se supone que las enzimas que transforman los PCBs presentan una localización citoplásmica y para que lleven a cabo sus actividades enzimáticas requieren de moléculas de agua. La mayoría de los PCBs son insolubles en agua por lo que en suelos se encontrarían firmemente adheridos a éste formando parte de una fase líquida no acuosa. Si las bacterias poseen movilidad y quimiotaxis, la degradación se llevaría a cabo más eficientemente ya que los microorganismos accederían más fácilmente a los compuestos a degradar. Posteriormente, las bacterias podrían secretar y/o excretar moléculas con actividades biosurfactantes (proteínas o polisacáridos) que facilitarían la emulsificación de la molécula de PCB. El resultado de estas interacciones sería un aumento en la biodisponibilidad del PCB para su posterior metabolismo. La movilidad y la quimiotaxis corresponden al movimiento directo de una bacteria acercándose o alejándose en las gradientes de un compuesto. Determinamos que Pseudomonas sp. B4 es más móvil que la cepa modelo B. xenovorans LB400. Observamos que la cepa más móvil presentó quimiotaxis hacia bifenilo y cloroderivados utilizando dos tipos de ensayos. La bacteria también fue atraída hacia el ácido benzoico, un intermediario de la degradación de bifenilo. El intermediario de la degradación de 3-clorobifenilo, 3 clorobenzoato, fue tóxico para Pseudomonas sp. B4. Debido a la falta de movilidad de la cepa modelo B. xenovorans LB400, los ensayos para demostrar quimiotaxis no se pudieron realizar con este microorganismo. Los microorganimos degradadores de PCBs debiesen tener la capacidad para moverse y responder agradientes formadas por estos compuestos haciendo más eficiente la biorremediación. Por otra parte, estudiamos la presencia de actividades emulsificantes en los sobrenadantes de cultivo de las bacterias en estudio. En la búsqueda de estas actividades se evidenció, mediante microscopía electrónica, la presencia de un material amorfo que rodeó a la envoltura celular en la fase exponencial y que disminuyó en la fase estacionaria. Este material estuvo presente en forma independiente del sustrato en el cual se crecieron ambas bacterias. Por análisis cromatográficos de estos compuestos encontramos que estos posiblemente correspondan a sustancias exopoliméricas (EPS) constituídas por manosa, glucosa y galactosa en Psendomonas sp. B4 y dos tipos de EPS en B. xenovorans LB400 constituídos por glucosa y galactosa. Sin embargo, evidenciamos que muestras liofilizadas provenientes de los sobrenadantes de cultivo de ambas bacterias extraídas de las dos fases de crecimiento, carecieron de actividad emulsificante hacia una mezcla de dos compuestos hidrofóbicos. Finalmente se abordó la caracterización diferencial de las proteínas extracelulares en B. xenovorans LB400. Primero, mediante un análisis in silico encontramos que esta bacteria y algunos miembros del género Burkholderiae secretarían entre un 13-19 % de sus proteomas. B. xenovorans LB400 posee 1.195 proteínas que podrían ser destinadas a la membrana interna, al espacio periplásmico, la membrana externa y/o al espacio extracelular. Una de estas proteínas presentó un 26,7% de identidad con la AlnA de Acinetobacter radioresistens K53, el caso más estudiado de proteínas extracelulares con actividad emulsificante hacia compuestos hidrofóbicos. Sin embargo, el ortólogo de B. xenovorans LB400 careció de dos de las cuatro regiones de la proteína AlnA, necesarias para la emulsificación de compuestos hidrofóbicos. Utilizando 2D-PAGE caracterizamos la expresión diferencial de las protefnas extracelulares en B. xenovorans LB400 en tres condiciones de cultivo. Encontramos que de las doce proteínas más abundantes en el sobrenadante, ocho de ellas se encontraron en nuestra lista de posibles proteínas secretadas, indicando que en efecto ellas son secretadas de forma activa al medio extracelular. Siete de estas doce proteínas se encontraron en mayor concentración en los sobrenadantes de cultivo de las células crecidas en bifenilo. Una de estas proteínas, que también se encontró en los sobrenadantes de células crecidas en ácido benzoico, corresponde a una proteína perteneciente a la superfamilia de las proteínas Ycel. Este grupo de proteínas presenta un pliegue similar al de las lipocalinas, proteínas caracterizadas por transportar y almacenar moléculas con naturaleza hidrofóbica. Esta proteína presenta una masa molecular de 21 kDa y un punto isoeléctrico de 7,3. Además, presentó un péptido señal de tipo sec que teóricamente tendría 22 residuos. La masa de la proteína madura sería de 18,8 kDa con un punto isoeléctrico de 6,3. Usando modelos cristalográficos ya descritos en la base de datos, determinamos que esta proteína presenta una estructura de tipo barril de ocho hebras B-antiparalelas en cuyo interior alberga residuos de aminoácidos con cadenas laterales de carácter apolar que interactuarían con las moléculas hidrofóbicas. Sugerimos que esta proteína podría estar involucrada en el transporte de moléculas tales como los PCBs desde el espacio extracelular hacia la membrana externa de la bacteria, fenómeno que es enteramente desconocido en estos microorganismos y que podría ser relevante en su actividad de biorremediación.

The release of pollutants to the environment, mainly by industrial processes, is in part responsible for the increase in the actual human health problems and biosphere damage. The bioremediation process seems to be the most convenient strategy to solve the problem caused by pollutants. In the last 25 years scientific investigation was focused mainly in the characterization at genetic and enzymatic level of metabolic routes which are involved in transformation of these compounds. The polyclorobiphenyl (PCBs) are hydrophobic molecules catalogued as priority pollutants. Microorganisms like bacteria are capable to transform some PCBs to less harmful molecules using special metabolic routes. Burkholderia xenovorans LB400 and Pseudomonas sp. B4 are two Gram-negative bacteria which can transform PCB molecules, and in some cases, use some PCBs molecules as the only carbon source. The bph locus in B. xenovorans LB400 encodes for enzymes which are involved in PCB transformation. It is assumed that enzymes which transform PCBs have an intracellular localization and for an efficient transformation they require water molecules for their activities. However, PCBs congeners are hydrophobic molecules and possibly they are adsorbed to solid surfaces being part of a non-aqueous liquid phase, limiting their bioavailability. Motility and chemotaxis phenomena and biosurfactant production are two physiological processes suggested to be necessary for an efficient degradation of РСB contaminated soils. Motility and chemotaxis should bring bacteria to the polluted sites where they eventually could secrete or excrete molecules (proteins or polysaccharides) with emulsifying activity. Motility and chemotaxis are two behavioral responses, that involve the direct movement of the bacteria towards or against a gradient of compound. We showed that Psendomonas sp. B4 is more motile than the model bacteria strain B. xenovorans LB400. We observed that Pseudomonas sp. B4 shown chemotaxis towards biphenyl and chlorobiphenyl using two different assays. Furthermore, this bacteria was attracted to benzoic acid, an intermediate of biphenyl degradation and 3-chlorobenzoic acid, the intermediate of 3- clorobiphenyl, was toxic for this bacteria. Due to the lack of motility of the model strain B. xenovorans LB400 the chemotaxis assay could not be performed in this microorganism. PCB degrading bacteria should have the ability to sense and swim to preformed gradients of these compounds generating a more efficient bioremediation process. We studied the presence of emulsifying activities in the supernatant of our two bacteria. First, we observed the presence of an amorphous material surrounding the cells, independent of the carbon source used to grown both bacteria. This material was abundant in exponential phase and diminished at the stationary phase. Bу chromatographic analysis, we determined that this material could be exopolymeric substances constituted mainly by mannose, glucose and galactose in Pseudomonas sp. B4 and two types of EPS in B. xenovorans LB400 composed mainly by glucose and galactose molecules. We demonstrated that the crude fraction of these supernatants have a weak emulsifying activity against a mix of two hydrophobic molecules. We initiate the analysis of the extracellular proteins of B. xenovorans LB400 in order to characterize the extracellular components which could be involved in the interaction with hydrophobic compounds such as biphenyl or PCB in the supernatant of these bacteria. First, by in silico analysis, we found that this bacteria and some members of the genera secretes between a 13-19% of their proteomes. B. xenovorans LB400 secreted 1.195 proteins which are possibly located to inner membrane, periplasmic space, external membrane and extracellular space. One of this proteins had 26,7% of identity with AlnA from Acinetobacter radioresistens K53, the most studied example of extracellular proteins with emulsifying activity toward hydrophobic compounds. However, two of four regions which were necessary for emulsification were missing in the B. xenovorans LB400 orthologue. Using a 2D-PAGE approach we characterized the differential protein expression pattern of extracellular proteins in B. xenovorans LB400. We found that in the twelve most abundant proteins, eight were found in our secreted list of proteins, suggesting truly secreted fractions. Seven of twelve proteins were found in high levels at the culture supernatants fractions from biphenyl growing cells. One of these proteins, which was also found in the benzoic acid culture supernatants, belongs to the Ycel superfamily of proteins. This group of proteins have a similar structure to the lipocalin family which store and transport hydrophobic molecules. This protein has 21 kDa of molecular mass and an isoelectric point of 7,3. Besides, it showed a signal peptide of sec type which teorically has 22 aminoacid residues, giving a mature protein of 18,8 kDa with an isoelectric point of 6,3. We used the aminoacidic sequence of this protein to create a 3D model using crystallographic data derived of some members of this superfamily. This protein has a barrel shape composed of eight B-antiparallel secondary structure that suggest that this protein could bind molecules of hydrophobic nature as predicted by the lateral non-polar residues present inside the barrel. We suggest that this protein could be involved in the transport or storage of molecules such as PCBs from the contamination site to the bacterial surface. So far, this is an unknown phenomenon that could play a key role in the PCB metabolism and that will be of a great concern for future studies.