Efecto de los sustratos en la modificación de los grupos sulfhidrilo de fosfofructoquinasas tipo 2 de escherichia coli

Abstract

La cepa silvestre de E. coli presenta dos isoenzimas de fosfofructoquinasa. Pfk-1 es la isoenzima principal у Pfk-2 la minoritaria. Cepas con la mutación pfkB1 presentan niveles aumentados de Pfk-2, y cepas con la mutación cercana pfkB10 presentan una enzima alterada estructuralmente, Pfk-2*. Cepas que no contienen Pfk-1 pero con altos niveles de Pfk-2 crecen bien en glucosa y en sustratos gluconeogénicos, mientras que cepas isogénicas con altos niveles de Pfk-2* crecen bien en glucosa pero muy 1entamente en compuestos gluconeogénicos. Pfk-2 y Pfk-2* difieren en su estabilidad a temperaturas bajas, en su mecanismo cinético, susceptibilidad a la inhibición por fructosa-1,6-P₂ y MgATP-2, y en el efecto de ligandos en el estado de agregación. En esta Tesis se continúa la caracterización estructural de las enzimas por medio del estudio de la modificación química de grupos-SH y la importancia de éstos en la actividad de Pfk-2 y Pfk-2*. Se observó una mayor reactividad de Pfk-2*, comparada con Pfk-2, hacia DTNB y NEM. En ambos casos Pfk-2 y Pfk-2* presentan dos fases de inactivación con cinética de pseudoprimer orden, una rápida y otra lenta. El proceso de inactivación es dependiente de la concentración del reactivo modificador y ocurre sin la formación previa de un complejo enzima-reactivo. El valor de la constante de segundo orden para la primera fase de inactivación de Pfk-2* a 0°C es 25 veces superior al de Pfk-2. Estos resultados sugieren, entre otras posibilidades, que grupos-SH importantes para la actividad de las enzimas que reaccionan con los reactivos modificadores son más reactivos en Pfk-2* que en Pfk-2, están más accesibles, o ambos a la vez. MgATP actuó como protector frente a la inactivación de Pfk-2 por DTNB y NEM, mientras que el efecto protector del fructosa-6-P fue parcial. Al aumentar la concentración de fructosa-6-P en presencia de MGATP-2 disminuyó el efeсto protector de este último. Estos resultados se relacionan con los obtenidos mediante estudios cinéticos y fisicoquímicos en los cuales fructosa-6-P, por una parte, dismi- -2 nuye la inhibición que produce MgATP y, por otra, revierte la tetramerización producida por el nucleótido. La unión del fructosa-6-P junto con ATP-4 no protege a la inactivación. Estos experimentos sugieren que los grupos SH no están ubicados en el sitio activo y que la protección por MgATP- está relacionada con la unión del nucleótido a un sitio alostérico regulatorio para el mismo. En el caso de Pfk-2*, MgATP-2 no actuó como protector de la inactivación y el efecto del fructosa-6-P fue también parcial. Sin embargo, al aumentar la concentración de MgATP-2 en presencia de fructosa-6-P la protección aumentó notablemente. En forma diferente a lo observado para Pfk-2, la reacción de los grupos-SH de Pfk-2* provocó la inactivación total de la enzima. Estos resultados sugieren que la protección observada por fructosa-6-P y MGATP-2 en conjunto, se debe a la unión de éstos al sitio activo. Esto enmascararía a los grupos-SH ubicados en este sitio o provocaría un cambio conformacional que impediría la reacción de los grupos SH importantes para la actividad ubicados en un sitio distinto del activo.

The wild type strain of E. coli contains two phosphofructokinase isozymes. Pfk-1 is the main isozyme and Pfk-2 the minor one. Strains with the pfkB1 mutation present increased levels of Pfk-2 while strains with a closely linked mutation contain a structurally altered enzyme, Pfk-2*. Strains lacking Pfk-1 that contain high levels of Pfk-2 grow well on sugars and gluconeogenic compounds, while isogenic strains with high levels of Pfk-2* grow well on sugars, but very slowly under gluconeogenic conditions. Pfk-2 and Pfk-2* differ in their stability at low temperatures, kinetic reaction mechanism, inhibitability -2 by fructose-1,6-P₂ and MgATP , and effect of ligands on their aggregation states. In this Thesis advances will be made in the structural characterization of the enzymes by chemical modification of SH-groups important for the activity of Pfk-2 and Pfk-2*. Pfk-2* reacted more readily towards DTNB and NEM compared with Pfk-2. In both cases, Pfk-2 and Pfk-2 showed two inactivation phases with pseudofirst order kinetics, a fast and a slow one. The inactivation process was dependent on the concentration of the reagent and proceeds without the previous formation of an enzymereagent complex. The second order rate constant for the fast inactivation phase of Pfk-2* at 0°C is 25-fold higher than the one for Pfk-2. These results suggest, between other possibilities, that SH-groups important for the activity of the enzymes that react with the reagent are more reactive in Pfk-2* than Pfk-2, and/or are more accesible. MgATP2- protected Pfk-2 against inactivation by DTNB and NEM, while the effect of fructose-6-P was only partial. The protective effect of the nucleotide diminished upon increasing the fructose-6-P concentration in the presence of M9ATP2-. These results are related with the those obtained by kinetic and sedimentation studies in which, on the one hand, fructose-6-P diminishes 2- the inhibitability of Pfk-2 by MgAТР²--, and on the other, reverts the tetramerization produced by the nucleotide. The binding of fructose-6-Pp together with ATp4- did not show protection against inactivation. These results, taken together, suggest that the SH groups are not located at the active site and that the MgATP2- protection is related to the binding of the nucleotide to an allosteric regulatory site. In the case of Pfk-2* MgATP2- did not protect the enzyme against inactivation, and the effect of fructose-6-P was only partial. Nevertheless, the protective effect increased considerably upon increasing the MgATP2- in the presence of fructose-6-P. Contrary to the results obtained with Pfk-2, the reaction of the SH-groups in Pfk-2* resulted in a complete inactivation of the enzyme. These results suggest that the effect 2- observed in the presence of fructose-6-P and MgATP is due to the binding of these compounds to the active site of the enzyme. This could mask the SH-groups located at this site or would provoke a conformational change that does not allow the reaction of the SH groups important for the activity located at a site other than the active site.