Estudio funcional de la vía del segundo mensajero C-DI-GMP de Acidithiobacillus thiooxidans DSM 9463

Abstract

Las biopelículas son ecosistemas microbianos organizados conformados por múltiples clases de microorganismos envueltos en una matriz extracelular sobre una superficie viva o inerte. Estas estructuras poseen gran importancia en los ámbitos de la ecología, la biominería, la biorremediación y la medicina. Debido a su importancia en el proceso de biolixiviación, ya que permite un contacto estrecho entre microorganismo y sustrato, nuestro laboratorio se ha enfocado en caracterizar los mecanismos moleculares de formación de biopelículas en bacterias biominera pertenecientes al género Acidithiobacillus.. La formación de biopelículas es un proceso muy complejo que se encuentra regulado a múltiples niveles. En numerosas bacterias Gram-negativas, los procesos de adhesión a superficies y formación de biopelículas se encuentran bajo la regulación del segundo mensajero diguanilato cíclico (c-di-GMP). Éste es sintetizado a partir de GTP por proteínas con actividad diguanilato ciclasas (DGCs) y degradado por proteínas fosfodiesterasas (PDEs). Mediante seis clases de receptores de naturaleza proteica y un dominio receptor conservado en la región 5' no codificante en algunos mRNA ("riboswitch") se regulan procesos como motilidad, secreción de factores de adhesión a superficies, formación de biopelículas, respuesta a estrés ambiental y virulencia. Debido a la importancia del c-di-GMP en la regulación del proceso de formación de biopelículas, se decidió determinar si la bacteria biominera Acidithiobacillus thiooxidans poseía una vía del c-di-GMP funcional, tal como había sido descrito para Acidithiobacillus ferrooxidans, una bacteria mesófila oxidante de ión ferroso y compuestos de azufre, y Acidithiobacillus caldus, una bacteria termófila moderada oxidante de compuestos de azufre. At. thiooxidans, como otros miembros del género Acidithiobacillus, es una y-proteobacteria, acidófila y quimiolitoautotrófica que oxida azufre elemental y compuestos reducidos de azufre. Comparte el mismo ambiente que At. ferrooxidans, sin embargo At. thiooxidans es incapaz de oxidar hierro o pirita, pero es capaz de resistir pH más extremos que At. ferrooxidans. Se sabe que At. thiooxidans es capaz de formar biopelículas sobre la superficie de los minerales, pero los mecanismos moleculares que controlan este fenotipo siguen siendo desconocidos. El análisis bioinformático de la secuencia genómica de la cepa tipo ATCС 19377 de At. thiooxidans reveló la presencia de 25 posibles genes que codificarían para proteínas con dominios relacionados con el metabolismo del c-di-GMP y además diez putativos genes codificando proteínas efectoras capaces de unir c-di-GMP. Dentro de estas se encuentran PelD y CelA, que formarían parte de complejos multiproteicos de membrana que sintetizan exopolisacáridos de tipo Pel o celulosa, respectivamente. Al comparar la secuencia aminoacídica de los dominios identificados con dominios funcionales, se determinó que la mayoría poseen los aminoácidos clave para su función. Mediante experimentos de RT-PCR, se demostró que la mayoría de los genes estudiados en la cepa DSM 9463 se expresan bajo las condiciones de crecimiento utilizadas. Por otro lado, al analizar por espectrometría de masas los extractos enriquecidos en nucleótidos a partir de células de At. thiooxidans crecidas en diferentes sustratos energéticos, se detectó la presencia de c-di-GMP, lo cual permite concluir que esta especie de Acidithiobacillus también es capaz de producir este segundo mensajero. Finalmente, al realizar ensayos de complementación heteróloga en cepas mutantes de Salmonella enterica serovar Typhimurium se demostró que los genes AthiA1_08189, AthiAl_08219, AthiA1_08224 y AthiAl_15675 restauran el fenotipo rugoso de la ceра mutante en una diguanilato ciclasa (DGC), indicando por ende que éstos codifican DGCs funcionales. Este conjunto de resultados permite concluir que la bacteria biominera Acidithiobacillus thiooxidans tiene una vía del c-di-GMP funcional y que podría estar involucrada en la regulación de la formación de biopelículas mediante la síntesis de exopolisacáridos de tipo Pel, de tipo celulosa, o ambos.

Biofilms are organized microbial ecosystems made up of multiple classes of microorganisms involved in extracellular matrix on a living or inert surface. These structures have great importance in the fields of ecology, bio-mining, bioremediation and medicine. Because of its importance in the process of bioleaching, allowing close contact between microorganism and substrate, our laboratory has focused on characterizing the molecular mechanisms of biofilm formation in biomining bacteria belonging to the genus Acidithiobacillus. Biofilm formation is a complex process that is regulated at multiple levels. In many Gram-negative bacterias, the processes of adhesion to surfaces and biofilm formation are under the regulation of second messenger c-di-GMP. This is synthesized from GTP by proteins with diguanylate cyclases activity (DGCS) and degraded by phosphodiesterases proteins (PDEs). Through six classes of proteinaceous receptors and a conserved domain in 5' untranslated region in some mRNAs ("riboswitch") regulate processes such as motility, secretion of factors of adhesion to surfaces, biofilm formation, response to environmental stress and virulence. Due of the importance of c-di-GMP in biofilm formation, it was decided to determine if the booming bacteria Acidithiobacillus thiooxidans possessed a functional c-di-GMP pathway, as had been described for Acidithiobacillus ferrooxidans, an iron and sulfur compounds oxidizing bacteria, and Acidithiobacillus caldus, a moderate thermophilic, sulfur compounds oxidizing bacteria. At. thiooxidans, like other members from Acidithiobacillus genus, is an acidophilic and chemolithoauthotrophic Yproteobacteria oxidizing elemental sulfur or reduced sulfur compounds. It share the same environment that At. ferrooxidans, however, At. thiooxidans is not capable to oxidize iron or pirite, but is capable resist more extreme pH than At. ferrooxidans. Is known that At. thiooxidans is capable to form biofilms in mineral surfaces, but the molecular mechanisms that control this phenotype are still unknown. Bioinformatic analysis of the genomic sequence of the type strain ATCC 19377 of At. thiooxidans revealed the presence of 25 potential genes that encode for proteins with functions related to metabolism plus ten putative genes encoding proteins involved in signaling of c-di-GMP, within which are PelD and CelA. By comparing the amino acid sequence of the domains identified with functional domains, we found that most possessed the key amino acids for its function. This suggests the existence of a functional pathway in this organism. By RT-PCR experiments showed that most studied of strain DSM 9463 are expressed under the growth conditions used. Furthermore, the analysis by mass spectrometry of nucleotide enriched extracts from cells of At. thiooxidans grown on different energy substrates detected the presence of c-di-GMP, which allows the conclusion that this species of Acidithiobacillus is also capable of producing this second messenger. Finally, by heterologous complementation assays in mutant strains of Salmonella enterica serovar Typhimurium demostrated that AthiAl_08189, AthiAl_08219, AthiAl_08224 and AthiAl_15675 genes restore the rough phenotype of the mutant strain in a diguanylate cyclase (DGC), thus indicating that these genes encode functional DGCs. These results allow conclude that the biomining bacteria Acidithiobacillus thiooxidans has a functional c-di-GMP pathway that could be involved in regulation of biofilm formation through the exopolysaccharide synthesis, either Pel type or cellulose type, or both.