Role of the CaMKII/NMDAR complex in the maintenance of the basal and potentiated synaptic transmission (Rol del complejo CaMKLL/NMDAR en la mantención de la transmision sináptica basal y potenciada)

Abstract

La quinasa Il dependiente de Ca+2/Calmodulina (CaMKII) es una proteína abundante en varios tipos de tejido. Esta constituye el 1-2% de la proteína total del cerebro (Lisman et al., 2002). CaMKII se encuentra enriquecida en las densidades postsinápticas (PSD), una especialización del citoesqueleto que se encuentra presente en las espinas dendríticas de las sinapsis glutamatérgicas, en ellas se organiza la maquinaria sináptica, que incluye receptores de neurotransmisores proteínas de andamio y enzimas. En las PSD, CaMKII no solo jugaría un rol como quinasa, también puede unirse directamente a una serie de proteínas, incluyendo al receptor de glutamato tipo NMDA (NMDAR). Durante la potenciación a largo plazo (LTP), un modelo de plasticidad y aprendizaje comúnmente utilizado, las sinapsis experimentan cambios estables en la fuerza sináptica luego de un periodo de intensa actividad. En la región de CA1 del hipocampo, una estructura cerebral relacionada con la memoria y ubicación espacial, la inducción y los mecanismos de expresión de LTP han sido ampliamente estudiados, pero los procesos moleculares que mantienen dichos cambios no han sido identificados. Al aumentar la actividad sináptica, CaMKII migra desde el citoplasma hasta las PSD, donde se une con la subunidad NR2B de los NMDAR. Es destacable que si esta interacción se interrumpe, la inducción de LTP y el aprendizaje también. En esta tesis se prueba la hipotesis de que el complejo formado por CaMKII y NMDAR podría constituir un tipo de memoria sináptica. Para determinar si una molécula es importante no para el proceso de memoria celular, se debe primero probar que al intervenir con dicha molécula se produce una reversión persistente de la LTP. Por otro lado, si la LTP ocurre naturalmente en la vida del animal, es de esperar que un componente de la intensidad de la sinapsis dependa de la estabilidad de esta molécula. Como una primera aproximación para probar la importancia del complejo CaMKII/NMDAR para la mantención de la transmisión sináptica, se utilizaron distintas secuencias peptídicas construidas en base a las regiones de interacción entre CaMKII y NMDAR. Estos agentes fueron aplicados en rebanadas de hipocampo de rata, al mismo tempo que se realizaban registros electrofisiológicos para medir la transmisión sináptica. Los resultados de estos experimentos fueron difíciles de interpretar, debido a un efecto inespecífico de una región de la secuencia peptídica utilizada para la incorporación a las células. Recientemente se ha descrito una nueva familia de péptidos (péptidos CN), derivados de una proteína endógena de función desconocida. Estos péptidos han mostrado, in vitro, inhibir la actividad de CaMKII inducida por Ca+2/Calmodulina, tanto a nivel de su actividad como quinasa, como su unión a NR2B. Al acoplar estos péptidos con una secuencia de incorporación derivada de una de las proteínas del virus VIH (tatCN) no se observaron efectos inespecíficos como en los primeros experimentos. En este trabajo se muestra que la aplicación transitoria de estos péptidos produce una reducción persistente en la transmisión sináptica basal. Lo anterior fue demostrado utilizando dos aproximaciones distintas: i) Registros antes, durante y después de la aplicación de tatCN. ii) Preincubación y posterior medida de la intensidad sináptica a través de curvas entrada/salida (curvas I/O). El mismo tratamiento puede revertir parcialmente procesos de LTP, esto queda de manifiesto ya que, luego de la aplicación transitoria de la droga, es posible inducir nuevamente LTP en vías previamente saturadas. Interesantemente, un efecto análogo se observó en la transmisión basal (no potenciada experimentalmente), en esta, el tratamiento con tatCN facilitó la inducción de una nueva LTP. Como complemento a esta tesis, nuestros colaboradores realizaron ensayos de coimmunoprecipitation en las mismas rebanadas utilizadas en los registros electrofisiológicos, esto para cuantificar la cantidad de CaMKII unida a NMDAR. Estos datos muestran que tatCN reduce la intensidad de la sinapsis a concentraciones suficientes para desestabilizar el complejo CaMKII/NMDAR, pero no a concentraciones lo suficientemente pequeñas como para afectar solo la actividad quinasa de la proteína. Otro resultado interesante obtenido por nuestros colaboradores, fue que la secuencia CN también produjo un efecto en rebanadas en cultivo capaces de expresar CaMKII acoplada а proteína fluorescente verde (GFP). En estas se observó una disminución en la cantidad de CaMKII asociada a la espina. En resumen, este trabajo muestra evidencia suficiente de que la intervención del complejo CaMKII/NMDAR en las PSD produce una reducción de la intensidad sináptica. Cabe destacar que tanto la reducción del complejo, como la caída en la intensidad de la señal, persistieron luego de la remoción del inhibidor. Más aún, la interrupción del complejo produce un desaturación de la LTP y facilita la inducción en una vía en la que no se ha inducido una LTP experimentalmente, sugiriendo una reversión del proceso. Consistente con estos resultados, el mismo tratamiento produce una relocalización de la quinasa en la espina dendrítica. Estos resultados apoyan la hipótesis de que el complejo CaMKII/NMDAR posee características de switch las cuales son importantes para la mantención de la intensidad sináptica.

The multifunctional Ca*²/Calmodulin-dependent kinase II (CaMKII) is an abundant protein in several tissues. It constitutes the 1-2% of total brain protein (Lisman et al., 2002). CaMKII is enriched in the Post Synaptic Densities (PSD), a cytoskeletal specialization of glutamatergic synapses, where the postsynaptic signaling machinery that includes neurotransmitter receptors, scaffold and regulatory proteins and enzymes, is organized. In the PSD, CaMKII may not only play a role as a kinase, it also can directly and indirectly bind a series of other proteins, including the NMDA-type glutamate receptor (NMDAR). During long-term potentiation (LTP), a broadly used synaptic plasticity model, synapses undergo stable changes in synaptic strength aftera period of intense synaptic activity. In hippocampal CA1 region, LTP induction and expression mechanisms have been extensively studied, but the molecular processes that maintain strength have not been identified. During high rate synaptic activity, CaMKII is translocated to the PSD, where it binds to the NR2B subunit of NMDARs. Notably, if this interaction is impaired, LTP induction and learning is disrupted. In this Thesis, we tested the hypothesis that the complex formed by CaMKII and the NMDAR may constitute a molecular memory at the synapse. To establish a molecule as a molecular memory, it must be shown that interfering with the molecule produces a persistent reversal of LTP. On the other hand, if LTP processes in fact occur during the previous animal life, it would be expected that a component of synaptic strength would depend on the stability of such molecular entity. As a first approximation to test the importance of the CaMKII/NMDAR complex for synaptic transmission maintenance, peptides derived from the interacting region between NMDAR and CaMKII were used. These agents were applied to brain slices during simultaneous recording of synaptic transmission. The results of these experiments were difficult to interpret, due to an unspecific effect of the peptidic sequence used to allow drug incorporation to cells. Recently, a new peptide family (CN peptides), derived from an endogenous protein of unknown function has been described. These peptides have been shown to specifically inhibit both CaMKIll activity and its binding to NR2B induced in vitro by Cat²/Calmodulin treatment. These peptides coupled to VIH protein sequence (tatCn) showed no unespecific effects. In this thesis work it was shown that the transient application of these peptides producesa persistent reduction in basal transmission. This was demonstrated by two different approaches: i) direct recording of transmission before, during, and after transient application of tatCN to the bath. ii) Preincubation and measurement of synaptic strength by construction of Input-Output curves (1/O Curves). The same treatment can also partially reverse saturated LTP, as transient drug application after induction allowed additional LTP to be induced. Interestingly, an analogous effect was observed for basal transmission (not potentiated during the experiment), as CN treatment facilitated posterior LTP induction. As a complement to this thesis work, coimmunoprecipitation assays were done by our collaborators in the same slices where electrophysiology experiments of this thesis were conducted, to quantify the binding of CaMKII and NMDAR. Comparisons of the data show that CN peptides decreases synaptic strength only at concentrations that disrupt the CaMKII/NMDAR complex, but not at lower concentrations, sufficient only to inhibit CaMKII activity. Also, applications of CN peptide to slice cultures expressing GFP-tagged CaMK1I actually affected CaMKII in living cells, causing a reduction in the bound amount of the kinase in the spine. In summary, we here show compelling evidence that interfering with CaMKII/NMDAR binding at PSD causes synaptic strength depression. Importantly, both the reduction of the complex and the reduction of the synaptic strength persisted after removal of the inhibitor. Moreover, complex disruption brings experimentally induced LTP out of saturation and facilitates subsequent LTP induction in a naïve pathway, suggesting a reversal of LTP processes. Consistent with these results, the same treatment caused delocalization of the kinase from a binding partner in the spine. These results support the hypothesis that the CaMKII/NMDAR complex has switch-like properties that are important in the maintenance of synaptic strength.