Influencia de factores celulares y proamiloidogénicos sobre la formación de inclusiones amiloides intracelulares de la microcina E492

Abstract

La microcina E492 (MccE492) es un péptido antibacteriano producido por la cepa Klebsiella pneumoniae RYC492, el cual se encuentra codificado dentro de un clúster génico que además codifica productos génicos que permiten su modificación posttraduccional y secreción. Resultados previos indican que la MccE492 forma agregados de naturaleza amiloide en el citoplasma de las células de E. coli cuando es expresada en presencia de los genes del clúster de producción, sugiriendo la existencia de factores proamiloidogénicos codificados dentro del clúster. La regulación de los agregados amiloides intracelulares de MccE492 podrían deberse a la acción de la proteína chaperona DnaK, relacionada con la solubilización de inclusiones intracelulares, impidiendo un efecto nocivo para las células acumuladoras. El objetivo de esta tesis fue estudiar la influencia de factores celulares en la formación de los agregados amiloides citoplasmáticos de MccE492, además de evaluar el efecto de estos agregados sobre la viabilidad celular. Mediante estrategias de sobreexpresión de MccE492 en presencia de distintos segmentos del clúster de producción de MccE492, se determinó que la expresión previa de MccE492 estimularía la formación de agregados amiloides intracelulares; mientras que el producto del gen orfL actuaría como un potenciador en la agregación al ser coexpresado con MccE492. Por otro lado, utilizando mutantes de MccE492 con distinta tendencia a la agregación, se determinó que los agregados amiloides intracelulares no afectan el metabolismo de las células productoras. Además, a través experimentos de pérdida y ganancia de función de DnaK, se estableció que ésta tiene un rol regulador en la amiloidogénesis intracelular de MccE492. |

Microcin E492 (MccE492) is an antibacterial peptide produced by the strain Klebsiella pneumoniae RYC492, which is encoded within a genetic cluster that also encodes gene products that allow its post-translational modification and secretion. Previous results indicate that MccE492 forms amyloid-like aggregates in the cytoplasm of E. coli cells when it is expressed in the presence of the genes from the production cluster, suggesting the existence of proamyloidogenic factors encoded within the cluster. The regulation of the MccE492 intracellular amyloid aggregates could be due to action of the chaperone protein DnaK, related to the solubilization of intracellular inclusions, preventing a harmful effect for the accumulator cells. The objective of this thesis was to study the influence of cellular factors in the formation of cytoplasmic amyloid aggregates of MccE492, in addition to evaluate the effect of these aggregates on the cellular viability. Through MccE492 overexpression strategies, in the presence of different segments of the MccE492 production cluster, it was determined that previous expression of MccE492 would stimulate the formation of intracellular amyloid aggregates; while the product of the orfl gene would act as an enhancer in the aggregation when coexpressed with MccE492. On the other hand, using MccE492 mutants with different aggregation tendency, it was determined that the intracellular amyloid aggregates do not affect the metabolism of the producing cells. In addition, through DnaK function loss and gain experiments, it was established that it has a regulatory role in intracellular MccE492 amyloidogenesis.