Contribución del efector SopB a la maduración de la Vacuola Contenedora de Salmonella en Dictyostelium discoideum y su rol en el remodelamiento de la vía endocítica del hospedero

Abstract

Salmonella es un género de bacterias Gram negativo que incluye más de 2500 serovares, los cuales se distinguen por los antígenos presentes en su superficie. Los serovares de S. enterica subespecie enterica son causantes de aproximadamente el 99% de los casos de salmonelosis a nivel mundial. El cuadro clínico asociados corresponde a una infección asintomática o un cuadro diarreico. S. Typhimurium es un serovar generalista que infecta animales de sangre caliente, incluyendo a los humanos, causándoles principalmente gastroenteritis. Los principales mecanismos de patogenicidad de Salmonella corresponden a los sistemas de secreción de tipo III (T3SS) codificados en las islas de patogenicidad SPI-1 y SPI-2, y las proteínas efectoras secretadas por ellos. Estas últimas participan en las distintas fases de la infección, incluyendo la maduración de la Vacuola Contenedora de Salmonella (SCV), compartimento membranoso que permite la replicación intracelular de la bacteria en las células del hospedero. La principal función de algunas proteínas efectoras se asocia a la biogénesis y maduración de la SCV, evitando su fusión con los lisosomas. Salmonella pasa la mayor parte de su ciclo de vida en el ambiente. Allí puede interactuar con distintos organismos depredadores, como los protozoos, pudiendo residir en su interior. Recientemente, nuestro grupo describió que S. Typhimurium es capaz de sobrevivir al interior de la ameba social Dictyostelium discoideum. Para ello, utiliza los T3SS codificados en las islas de patogenicidad SPI-1 y SPI-2 y muchos de sus efectores. Entre ellos, se ha demostrado que SopB contribuye a la supervivencia intracelular de S. Typhimurium en D. discoideum. Este efector es secretado por el T3SS codificado en la isla SPI-1 y posee actividad fosfatidil inositol fosfatasa, que permite modificar la distribución del fosfoinositido PI(4,5)P2 en células de mamífero. Además, en este mismo modelo se ha demostrado que recluta PI(3) quinasas que aumentan este tipo de fosfoinositidos en la SCV. Esto, entre otras acciones, contribuye a evitar la fusión de la SCV con los lisosomas de la célula hospedera. En esta tesis se buscó determinar si el efector SopB contribuye a inhibir la fusión de la SCV con los lisosomas de D. discoideum mediante ensayos de infección in vitro analizados mediante microscopía confocal. Además, se buscó determinar si SopB participa en alterar la distribución de lípidos hacia la SCV monitoreando esta estructura vacuolar a través de estudios de microscopía confocal. Para esto, se transformó la cepa silvestre y una mutante ΔsopB de S. Typhimurium con el plasmidio pFCcGi, que permite la expresión constitutiva de la proteína fluorescente mCherry. Para estudiar si las bacterias intracelulares colocalizan con lisosomas, se infectaron amebas con las cepas mencionadas en presencia del marcador lisosomal Lysotracker Green. Los resultados muestran que la mutante ΔsopB presenta una mayor proporción de bacterias que colocalizan con lisosomas de la ameba, en comparación con la cepa silvestre, tanto a 0,5 y a 1 horas post infección (hpi). Esto sugiere que SopB participa en evitar la degradación de esta bacteria por la vía lisosomal en D. discoideum. Para el estudio de la distribución de fosfoinositidos, se debió obtener cepas transformantes de D. discoideum que contienen plasmidios para la expresión de sondas fluorescentes que reconocen los fosfoinositidos PI(3)P o PI(4,5)P2. La transformación de esta ameba con DNA plasmidial se estandarizó durante el desarrollo de esta tesis, definiendo parámetros como la cantidad de DNA plasmidial a utilizar, el voltaje y la capacitancia. Las cepas transformantes se observaron mediante microscopía de epifluorescencia y se confirmó que emitían fluorescencia asociada a la expresión de estas sondas. Con estas cepas se procedió al estudio de la dinámica de fosfoinositidos. Para el caso de la cepa silvestre, se observó un nivel mayor de bacterias que se encontraban al interior de vacuolas PI(3)P+ a 0,5 hpi con respecto a la mutante ΔsopB. Esto sugiere que SopB genera un aumento de PI(3)P en la SCV a tiempos tempranos de infección. Sumado a esto, se evaluó si PI(4,5)P2 era retenido en la membrana que rodea a S. Typhimurium en D. discoideum, capturándose imágenes a tiempos muy cortos de infección (10, 20 y 30 s), y además a 0,5 y 1 hpi. Al momento de la internalización, S. Typhimurium retiene el fosfoinositido PI(4,5)P2 durante los primeros segundos en la membrana que la rodea, perdiéndose posteriormente. De esta forma, esta tesis permitió confirmar que S. Typhimurium modifica la distribución de PI(4,5)P2 durante la infección en D. discoideum. Por último, en este mismo modelo dicho fosfoinositido no fue retenido en la SCV a 0,5 y 1 hpi, tanto en el caso de la cepa silvestre como de la mutante ΔsopB, sugiriendo que SopB no está involucrado en la distribución de PI(4,5)P2 de forma posterior a los primeros segundos de la infección. Estos resultados contribuyen a entender de mejor manera los mecanismos mediante los cuales S. Typhimurium puede infectar fagocitos profesionales como D. discoideum y sobrevivir en el medio ambiente, contribuyendo al posible desarrollo de nuevas estrategias para controlar las infecciones causadas mundialmente por este patógeno

Salmonella is a genus of Gram-negative bacteria that includes more than 2500 serovars, which are distinguished by the antigens present on their surface. The serovars of S. enterica subspecies enterica are responsible for approximately 99% of cases of salmonellosis worldwide. The associated clinical picture corresponds to an asymptomatic infection or diarrhea. S. Typhimurium is a generalist serovar that infects warm-blooded animals, including humans, causing mainly gastroenteritis. The main mechanisms of pathogenicity of Salmonella correspond to the type III secretion systems (T3SS) encoded in the pathogenicity islands SPI-1 and SPI-2, and the effector proteins secreted by them. The latter are involved in the different phases of infection, including maturation of the Salmonella-containing vacuole (SCV), a membranous compartment that allows intracellular replication of the bacterium in host cells. The main function of some effector proteins is associated with the biogenesis and maturation of the SCV, preventing its fusion with lysosomes. Salmonella spends most of its life cycle in the environment. There it can interact with different predatory organisms, such as protozoa, being able to reside inside them. Recently, our group described that S. Typhimurium is able to survive inside the social amoeba Dictyostelium discoideum. For this purpose, it utilizes the T3SS encoded in the pathogenicity islands SPI-1 and SPI-2 and many of their effectors. Among them, SopB has been shown to contribute to the intracellular survival of S. Typhimurium in D. discoideum. This effector is secreted by the T3SS encoded in the SPI-1 island and possesses phosphatidylinositol phosphatase activity, which allows modification of the distribution of the phosphoinositide PI(4,5)P2 in mammalian cells. Furthermore, in this same model it has been shown that it recruits PI(3) kinases that increase this type of phosphoinositides in the SCV. This, among other actions, contributes to prevent SCV fusion with host cell lysosomes. In this thesis, we sought to determine whether the SopB effector contributes to inhibit SCV fusion with D. discoideum lysosomes by in vitro infection assays analyzed by confocal microscopy. In addition, we sought to determine whether SopB participates in altering lipid distribution to the SCV by monitoring this vacuolar structure through confocal microscopy studies. For this, wild-type and a ΔsopB mutant strain of S. Typhimurium were transformed with the plasmid pFCcGi, which allows constitutive expression of the fluorescent protein mCherry. To study whether intracellular bacteria colocalize with lysosomes, amoebae were infected with the above strains in the presence of the lysosomal marker Lysotracker Green. The results show that the ΔsopB mutant exhibits a higher proportion of bacteria that colocalize with amoeba lysosomes compared to the wild-type strain at both 0,5 and 1 h post infection (hpi). This suggests that SopB is involved in preventing degradation of this bacterium by the lysosomal pathway in D. discoideum. To study the distribution of phosphoinositides, transformant strains of D. discoideum containing plasmids that encode fluorescent probes recognizing PI(3)P or PI(4,5)P2 phosphoinositides had to be obtained. The transformation of this amoeba with plasmid DNA was standardized during the development of this thesis, defining parameters such as the amount of plasmid DNA to be used, voltage and capacitance. The transformant strains were observed by epifluorescence microscopy to confirm the emission of fluorescence associated with the expression of these probes. These strains were used to study the phosphoinositide dynamics. In the case of the wild-type strain, a higher level of bacteria inside PI(3)P+ vacuoles was observed at 0.5 hpi compared to the ΔsopB mutant. This suggests that SopB generates an increase of PI(3)P in the SCV at early times of infection. In addition, we evaluated whether PI(4,5)P2 was retained in the membrane surrounding S. Typhimurium in D. discoideum, capturing images at very short times of infection (10, 20 and 30 s), and also at 0.5 and 1 hpi. Upon internalization, S. Typhimurium retains the phosphoinositide PI(4,5)P2 during the first few seconds in the surrounding membrane and is subsequently lost. Thus, we confirmed that S. Typhimurium modifies the distribution of PI(4,5)P2 during infection in D. discoideum. Finally, in this model the phosphoinositide was not retained in the SCV at 0.5 and 1 hpi, both in the case of the wild-type and the ΔsopB mutant strains, suggesting that SopB is not involved in the distribution of PI(4,5)P2 after the first seconds of infection. These results contribute to a better understanding of the mechanisms by which S. Typhimurium can infect professional phagocytes such as D. discoideum and survive in the environment, contributing to the possible development of new strategies to control infections caused worldwide by this pathogen