Desarrollo de nuevos métodos analíticos para la determinación de antibióticos utilizados en la acuiculrura chilena

Abstract

En los últimos 30 años la industria salmonera, tanto nacional como mundial, ha crecido aceleradamente transformándose en una de las experiencias bio-tecnológicas más exitosas. Sin embargo, este rápido crecimiento ha traído consigo diversos problemas de tipo sanitario. Para enfrentar enfermedades de origen bacteriano, se han utilizado diversos fármacos antimicrobianos de uso veterinario mezclados con el alimento, produciendo una gran contaminación en el medio acuático con grandes cantidades de droga activa. Tanto esta contaminación, como la presencia de antibióticos en el producto final, trae asociado problemas para la salud humana. Es por ello que existen normativas vigentes en Chile y en los principales países exportadores e importadores de salmón, que normalizan la cantidad máxima permitida de algunos antibióticos en came y piel de pescado destinadas al consumo humano. En este contexto, es necesario disponer de métodos de determinación cuantitativos simples y de baja sofisticación instrumental. 이 Durante la realización de esta tesis, se desarrollaron metodologías por espectrofotometría derivada de primer orden, para la determinación individual simultánea de pares de los tres antibióticos comúnmente utilizados en la acuicultura chilena, oxitetraciclina, ácido oxolínico y flumequina. La proyección de la aplicación de estos métodos, sería en alimento de peces, porque las concentraciones de estos antibióticos en estas matrices son mayores a los límites de cuantificación encontrados de 5,0x10 mol/L. Por otra parte, se desarrolló un método analítico basado en la formación de par iónico para la determinación de oxitetraciclina en músculo de salmón, utilizando una técnica de determinación sencilla y de bajo costo instrumental como es la espectrofotometría derivada. Para ello, se incorporó un colorante de gran conjugación, violeta cristal-que interactuó con oxitetraciclina en medio amoniacal mediante una interacción de tipo electrostática. Luego el par iónico fue extraído en cloroformo y la evaluación de la señal analítica se realizó en dicho solvente por espectrofotometría derivada de segundo orden. La formación del par iónico VC-OTC, se confirmó por técnicas espectroscópicas, ¹H RMN, cálculos de T1, resonancia bidimensional y por FT-IR. La optimización de las variables fisicoquímicas y de extracción se realizaron por las metodologías univariables y por diseño experimental factorial, en un rango de concentración del antibiótico entre 4,0x107 y 20,0x107. De estas optimizaciones, se obtuvieron los siguientes resultados: concentración de VC 1,5x105 mol/L, concentración de NH3 2,0x10 mol/L (pH 9,0±0,2), volumen de extractante 6 mL y tiempo de extracción 4 minutos. De esta manera, se logró preconcentrar al antibiótico obteniéndose límites de cuantificación en músculo de salmón de 71 µg/Kg, los cuales se encuentran bajo los límites máximos residuales de 100 µg/Kg, para oxitetraciclina, que estipula la norma chilena para este tipo de matrices.

Over the past 30 years the salmon industry, both domestically and globally, has grown rapidly, becoming one of the most successful bio-technological experiences. However, this rapid growth has brought diverse problem of sanitary type. To deal with diseases of bacterial origin, several antibiotics veterinary has been used mixed with food. These facts produce pollution in the aquatic environment with large amounts of active drug. These contaminations, along with the presence of these antibiotics in the final product, produce human health problems. It is for this reason that Chilean law regulates the maximum concentration allowed of some of these antibiotics in fish meat and skin destined for human consumption. In this context, it becomes necessary to have quantitative methods of determination for this type of antibiotics, considering that these need to be simple, of low instrumental sophistication. During the realization of this thesis, methodologies were developed by spectrophotometry derivative of the first order, for determining individual or simultaneous pairs of the three antibiotics commonly used in the Chilean aquaculture, oxytetracycline, oxolinic acid and flumequine. The projection of the implementation of these methods, it is in food fish, because the concentrations of these antibiotics in these matrices are higher than the limits of quantification found of 5.0x10-6 On the other hand, an analytical methodology was developed, based on ion-pair formation for the determination of oxytetracycline (OTC) in salmon muscle, using a simple and inexpensive instrumental such as derivative spectrophotometry. In this methodology incorporates the use of the well known dye crystal violet (CV), which interacts with oxytetracycline by electrostatic interactions in an ammonia medium. Then the ion-pair formed is extracted into chloroform. The analytical signals were evaluated in the same solvent by second order derivative spectrophotometric technique. The formation of the ion-pair CV-OTC was confirmed by spectroscopic techniques which included 'H NMR, two dimensions spectroscopy and FT-IR. The optimizations of the physical-chemical and extraction variables were performed by univariate and methodologies for experimental factorial design, in a range of concentration of the antibiotic between 4.0x107 and 20.0x10-7 mo/L. The optimizations given the following results: VC concentration of 1.5 x10 -5 mol/L, concentration of NH₂ 2.0x10 mol/L (pH 9.0 ± 0.2), extracting volume of 6 mL and time extraction 4 minutes. In this way, we were able to obtain the antibiotic preconcentration limits of quantification in muscle of salmon of 71 µg/Kg, which is below the maximum residual of 100 µg/Kg, for oxytetracycline, which stipulates the standard for this type of Chilean matrixes.