Caracterización del patrón de isoformas de peroxidasas de pared celular en plantas de Hordeum vulgare L. infestadas con áfidos

Abstract

Las plantas al enfrentar diferentes tipos de estrés responden con aumento de la actividad de peroxidasas, el cual se puede focalizar en tejidos o estructuras subcelulares especificas. La actividad de peroxidasas unidas a la pared celular aumenta ante heridas causadas por agentes patógenos, plagas o daño mecánico. Las peroxidasas de la pared celular estan involucradas en procesos de síntesis y establecimiento de enlaces entre compuestos no celulósicos de la pared. Por ello, estas enzimas han sido implicadas en procesos de reparación de paredes dañadas. Este trabajo se realizó con el propósito de evaluar el efecto de la infestación con áfidos en la expresión de peroxidasas unidas iónica y covalentemente a la pared celular en plantas de Hordeum vulgare L. cv. Frontera. La actividad de las peroxidasas unidas iónica y covalentemente a la pared celular, fué medida en extractos obtenidos de plantas de 7, 10, 13 y 16 días de edad infestadas con Schizaphis graminum R. por 48 y 72 horas; así como en sus controles respectivos (sin infestar). También se midió la actividad de ambas peroxidasas en extractos obtenidos de la primera hoja de plantas de 13 días de edad, cuando fueron infestadas solamente la vaina o lámina por 72 horas. La actividad de peroxidasas unidas iónicamente a la pared determinada con oPDA aumentó, tanto en plantas sin infestar como infestadas de todas las edades. El mayor aumento de la actividad por infestación (104 %) en relación a las plantas sin infestar, se observó en plantas de 13 días de edad infestadas por 72 horas. La actividad de las peroxidasas unidas covalentemente a la pared celular también aumentó en las plantas sin infestar e infestadas, pero el aumento de esta actividad por infestación fué en menor grado que las iónicas. El mayor porcentaje de incremento de esta actividad (76%) se observó en plantas de 7 días infestadas por 72 horas, y fué disminuyendo con la edad de la planta. El isoelectroenfoque realizado con extactos conteniendo peroxidasas unidas iónicamente a la pared, mostró que hay 7 isoformas de peroxidasas (básicas en su mayoría) y que la infestación indujo una nueva isoforma con pI 6,76 en las plantas de 7 días de edad, la cual se mantuvo en plantas de 10 días. La actividad de las peroxidasas iónicas aumentó después de la infestación por aumento en la actividad de isoformas constitutivas de la pared celular, siendo la isoforma con pI 8,54 la que mostró un mayor aumento de actividad. En plantas de 10 días de edad sin infestar e infestadas se observó la aparición de una isoforma con pI 7,75, la cual se mantuvo en plantas de 13 y 16 días. El IEF de peroxidasas unidas covalentemente a la pared de plantas de 7 días de edad mostró mayor número de isoformas distribuídas en un rango más amplio de pH que las peroxidasas iónicas (ácidas en su mayoría). El aumento de la actividad de las peroxidasas covalentes por infestación se debió a isoformas ya presentes, principalmente de las isoformas con pI 7,60 у 5,95. La actividad de las peroxidasas unidas iónicamente a la pared celular en la primera hoja de plantas de 13 días de edad infestadas en las vainas, aumentó con respecto al control (de 14,7 a 27,8 U/gPS), pero esta actividad fué aún mayor en las vainas de hojas que fueron infestadas solamente en las láminas (38,9 U/gPS); en cambio no se observó variaciones en las láminas. La actividad unida covalentemente a la pared celular de vainas infestadas mostró un ligero aumento en relación al control y se mantuvo constante cuando fueron infestadas las láminas. Esta actividad en las láminas no experimentó cambios. Los resultados demuestran que la infestación por áfidos produce aumento de la actividad unida iónica y covalentemente a la pared celular. Las variaciones de ambas actividades depende de la edad de la planta y las peroxidasas iónicas son más inducibles que las covalentes. El IEF reveló la aparición de ina nueva isoforma en las peroxidasas iónicas por infestación, como también de una isoforma inducida por edad de la planta. También demostró que el aumento de la actividad de peroxidasas unidas tanto iónica como covalentemente a la pared se debió principalmente a isoformas constitutivas de la pared celular. La actividad de las peroxidasas iónica y covalentemente unidas a la pared celular se midió en zonas infestadas y alejadas de la infestación para determinar si en cebada había una respuesta sistémica. Se encontró que al infestar la lámina de la hoja la actividad iónica aumentó localmente y en la vaina de la hoja; sin embargo cuando se infestó la vaina, esta actividad aumentó sólo en esta estructura foliar. La actividad covalente aumentó en la vaina infestada y no en la lámina. Estos resultados indican que el daño producido por los áfidos puede ser reconocido en tejidos distantes de la infestación aumentando la actividad de las peroxidasas iónicas posiblemente como un mecanismo de protección a tejidos aún no infestados. Para establecer si el etileno está involucrado en el aumento de la actividad de peroxidasas de pared celular en plantas infestadas con S graminum, se cuantificó durante 9 horas la cantidad de etileno producido por plantas infestadas y sin infestar. Se encontró un aumento en la producción de etileno de un 52% más en plantas infestadas que en plantas control al término de las 9 horas. Pulsos de etileno dados en dosis de 40 ppm por 6 horas a plantas sanas indujo una mayor actividad de peroxidasas iónicas pero no de covalentes. Las peroxidasas iónicas aumentaron su actividad al doble de la actividad inicial y respecto al control sin etileno. Estos resultados sugieren que el etileno estaría participando como una señal en el sistema de activación de los mecanismos de resistencia de la pared celular en zonas infestadas de la cebada.

Responses of plants coping with different kinds of stress is represented by peroxidase activity induction, which is localized in tissues or specific subcellular structures. The cell wall-bound peroxidase activity increases in response to pathogen injury, pests or mechanical damage. The peroxidases in the cell wall are involved in synthetic processes and cross-links formation between non-cellulosic wall polymers. Thus, this enzyme have been related to repair events of cell walls. This work was carried out to study the effect of aphid infestation on the expression of ionically and covalently wall-bound peroxidases in plants of H. vulgare L. cv Frontera. The peroxidase activity of both ionically and covalently bound to cell walls were measured in plants of 7, 10, 13 and 16 days old infested with S. graminum for 48 and 72 h. The peroxidase activity was also measured from the first leaf of 13 day old plants infested for 72 hours at the sheath or at the lamina for 72 h. The ionically wall-bound peroxidase activity, mesaured with o-PDA, increased in the control and infested plants. The highest increase of peroxidase activity (104%) by aphid infestation was observed in plants of 13 days old infested for 72 h. Meanwhile, the covalently-bound wall peroxidase activity increased in the infested plants but less than in ionic peroxidases; the highest increase of peroxidase activity (76%) was observed in plants of 7 days old infested for 72 h and decreasing with the age of the plant. The isoelectrofocusing carried out with extracts containing ionically wall-bound peroxidases evidenced 7 peroxidases isoforms (mostly basic forms). A new isoform of pI 6.76 was induced in infested plants of 7 days old. This induced isoform was still present in infested plants of 10 days old. The ionically-bound wall peroxidase activity increased after infestation due to an increase of constitutive peroxidases of the cell wall, with the isoform of pI 8.54 showing the highest increase of activity. In plants of 10 days old, a new isoform of pI 7.75 was expressed in both infested and control plants of 13 and 16 days old. The IEF pattern of covalently-bound peroxidases from 7 days old plants, showed more isoforms distributed in a wide pH range than the ionically-bound peroxidases. The increase of activity of covalently-bound peroxidases after infestation was mainly due to an increase of the activity of isoforms pI 7.60 and 5.95. The ionically-bound peroxidase activity in the sheath of the first leaf of 13 days old plants when infested at the sheath, increased from 14.7 to 27.8 U/g dry wt, but in plants infested at the lamina the activity in the sheath raised to 38.9 U/g dry wt with no changes at the lamina. The covalently wall-bound activity from infested sheath, showed a light increasing over the control, which was kept constant when the lamina was infested. No changes of this activity was evidenced in the lamina. The results demostrate that the aphid infestation increase the activity of both ionically and covalently-bound cell walls peroxidases. The alterations in both activities depend on the age of the plant and the ionically-bound activity shows a higher level of induction than the covalently-bound peroxidases. The IEF showed a new isoform in the ionic peroxidase under infestation, and a new isoform induced by the aging of the plant. the wall-bound peroxidase activity was due to an increase in the constitutive isoforms of the cell wall. To explore a possible systemic response in infested barley, peroxidase activity of ionically and covalently-bound wall were measured in locally infested zones and distant zones from the infestation. In the infested lamina the ionically-bound peroxidases increased locally and in the leaf sheath; but when sheath was infested, this peroxidase activity increased only locally. The covalently-bound activity increased in the infested sheath only. This results indicate that the damage by aphids can be recognized in distant tissues from the infestation, functioning like a protection mechanism of non infested. tissues. To determinate ifthe ethylene is involved in the increase of the activity of cell wall peroxidases in infested plants with S. graminum, ethylene released was measured in infested and non infested plants for 9 h. Ethylene increased 52% in infested plants after 9 h of treatment. Ethylene pulses of 40 ppm for 6 h in healthy plants induced high ionicallybound activity but not the covalently-bound peroxidases. The ionically-bound activity increased twice respect to non treated control plants. These results suggest that ethylene could participate as signal in the activation of resistant mechanisms in the cell wall of infested barley plants.