Fagos de la cepa pandémica de Vibrio parahaemolyticus y sus efectos en el crecimiento y competitividad de la bacteria

Abstract

V. parahaemolyticus, es un bacilo Gram negativo, halófilo, que habita en estuarios y ambientes marinos, y causa miles de casos anuales de gastroenteritis asociados al consumo de mariscos crudos a nivel mundial. Desde 1996, la mayoría de los casos han sido asociados a un mismo clon, conocido como clon pandémico O3:K6. En Chile, hasta la fecha, ha causado más de 16.000 casos causando serios problemas de salud y económicos en las regiones productoras de mariscos. Como la infección por V. parahaemolyticus ocurre exclusivamente por el consumo de mariscos que contengan una dosis infecciosa de esta bacteria (10 6 UFC/mL ), es de gran interés entender los factores que determinan su abundancia en el litoral. Para esto es necesario conocer su ecología, y uno de los factores más importantes en la ecología de bacterias es la presencia de fagos. Esta tesis explora la abundancia de fagos contra V. parahaemolyticus y su efecto en el crecimiento y competitividad de la bacteria. En este trabajo se aisló y caracterizó 13 podofagos capaces de infectar la cepa pandémica de V. parahaemolyticus, 4 provenientes de México y 7 provenientes del sur de Chile. La secuenciación de los genes de DNA polimerasa, RNA polimerasa y exonucleasa de estos fagos reveló que los 13 fagos están estrechamente relacionados, compartiendo por lo menos un 90 % de identidad a nivel nucleotídico en estos genes. Se seleccionó el fago VP93 para una caracterización más detallada y la secuencia de su genoma reveló que este grupo de fagos pertenece a un sub-grupo de fagos tipo T7, conocido como grupo ФKMV, que estaba compuesto hasta el aislamiento de VP93 exclusivamente por fagos de Pseudomonas aeruginosa. Los resultados muestran que el fago produce placas de lisis turbias y no afecta notoriamente el crecimiento de la bacteria, incluso utilizando altas multiplicidades de infección, además se observó que estos cultivos presentan entre un 50 y 90% de bacterias naturalmente resistentes. A pesar de esto el fago es capaz de replicarse y persistir junto a la bacteria incluso después de 5 sub-cultivos seriados a una proporción aproximada de un fago por bacteria. La persistencia del fago no se debe a la presencia de bacterias lisogénicas ya que no se encontró rastros de genes del fago en las bacterias resistentes en estos cultivos. Además VP93 pertenece un grupo de fagos líticos sin genes asociados a fagos temperados. Este fenómeno ha sido conocido como "carrier state" o pseudolisogenia y puede ser explicado por la presencia en el cultivo de dos sub-poblaciones, una resistente y otra sensible al fago, ambas a concentraciones similares e intercambiables entre si a una alta frecuencia similar para ambas direcciones. La continua presencia de estas dos sub-poblaciones podría explicarse por un mecanismo de cambio de fase, donde las bacterias resistentes regeneran a las bacterias sensibles en las que el fago puede continuar replicándose y así persistir en el cultivo. V. parahaemolyticus presenta un cambio de fase reversible apreciable por la existencia de colonias opacas (op) y translúcidas (tr). Sin embargo, los resultados de infección con VP93 en cultivos de bacterias provenientes de colonias opacas o translúcidas sugieren que la resistencia a VP93 no está asociada a este cambio observado. De cualquier modo este hecho no permite descartar que la resistencia al fago esté relacionada con nu mecanismo de cambio de fase distinto al mencionado. Intentos por encontrar clones resistentes y sensibles no fueron exitosos, esto podría esperarse si la tasa de intercambio de bacterias sensibles a resistentes y viceversa fuese similar a 0,01 por generación, ya que las colonias tendrían ambos tipos de bacterias, aunque provienen de una sola célula. Esta situación fue modelada utilizando el programa Berkeley Madonna y los resultados arrojados por el modelo se ajustan a los obtenidos experimentalmente. Estos datos sugieren fuertemente que la explicación propuesta sería cierta. Con el fin de determinar factores que podrían estar involucrados en la resistencia a VP93 se generó una mutante en el gen hsdR del sistema de restricción modificación tipo 1. Los sistemas de restricción bacterianos participan activamente en la defensa contra fagos e incluso se ha visto que pueden estar regulados por un mecanismo de cambio de fase. Sin embargo, los resultados obtenidos al infectar la mutante generada con VP93, muestran que, al igual que con la cepa silvestre, el fago no afecta notoriamente su crecimiento. Finalmente se exploró el efecto de VP93 en la competitividad de la cepа pandémica de V. parahaemolyticus con otras cepas de la misma especie que coexisten en mariscos. Se logró determinar que VP93 es capaz de infectar cerca del 50% de cepas no pandémicas de V. parahaemolyticus aisladas desde mariscos. Además se observó que al realizar un co-cultivo entre la cepa pandémica PMC57.5 y la сepa no pandémica PMA112 sensible al fago, la presencia de VP93 favorece la prevalencia de la сера pandémica. En ausencia del fago la cepa PMA112 está presente en una mayor proporción en el cultivo, en cambio, cuando el fago está presente, prevalece la cepa pandémica y la cepa PMA112 es indetectable. Por otro lado, cuando un co-cultivo de la cepa pandémica con una сера по pandémica que es resistente al fago es infectado con VP93, la proporción de cada cepa es similar a lo observado en co-cultivos no infectados. Estos resultados sugieren que la interacción entre VP93 y la cepa pandémica de V. parahaemolyticus parece ser ventajosa tanto para el fago como la bacteria, ya que, un fago que mate completamente a su hospedero eventualmente no encontraría una célula donde replicarse, mientras que para la bacteria resulta conveniente convivir con un fago que le permita crecer sin mayores problemas. Además la presencia de VP93 representaría una ventaja para la cepa pandémica de V. parahaemolyticus porque podría matar otras cepas no pandémicas que estén compitiendo en el mismo hábitat.

V. parahaemolyticus, a Gram-negative bacillus, halophilic, which lives in estuaries and marine environments causes globally thousands of gastroenteritis cases associated with seafood consumption each year. Since 1996, most cases are associated with a single clone, known as pandemic clone 03:K6. In Chile has caused since 2004 over 16,000 cases with serious health and economic problems in the seafood producing regions. As the infection by V. parahaemolyticus occurs exclusively by consumption of shellfish that contain an infectious dose of bacteria, it is of great interest to understand the factors that determine its abundance in the littoral. This aim requires knowledge about the ecology of this bacterium. Being phages one of the most important causes of bacterial death in the ocean, this thesis explored the abundance of phages against V. parahaemolyticus and their effect on growth and competitiveness of the bacteria. In this work 13 podophages capable of infecting pandemic strain of V. parahaemolyticus were isolated and characterized, four from Mexico and seven from southern Chile. The sequencing of DNA polymerase, RNA polymerase and Exonuclease genes revealed that all the 13 phages are closely related sharing at least 90% identity at the nucleotide level on theses genes. VP93 phage was selected for a detailed characterization and its genome sequence revealed that this group phages belong to a sub-group of T7-like phages, known as ФKMV group, which contained exclusively Pseudomonas phages until VP93 was isolated. VP93 produces turbid plaques and does not seriously harm pandemic V. parahaemolyticus growth, even at high multiplicities of infection. Cultures of the host bacteria contain between 50 and 90% of naturally resistant bacteria. Despite these observations the phage is able to replicate and persist in bacterial cultures even after 5 serial sub-cultures, attaining an approximate constant ratio of one phage per bacterium. The persistence of phage in the cultures is not due to presence of lysogenic bacteria because phage genes were not found in resistant bacteria obtained from these persistently infected cultures. Besides VP93 is part of a lytic phage group not associated with temperate phage genes. This persistence of non temperate phages in bacterial cultures has been known as "carrier state" or pseudolisogeny and in the case of VP93/pandemic strain case was explained by the presence of two sub-populations in the culture, one resistant and another sensitive to the phage, both present at similar concentrations even in clonal cultures, that are interchangeable between them at high similar frequency in both directions. The presence of these two sub-populations in clonal cultures could be explained by a phase change mechanism, where the resistant bacteria can regenerate sensitive bacteria. Phage persisting in bacterial cultures would replicate in the sensitive cells generated at high frequency from the resistant cells. V. parahaemolyticus has a reversible phase change observed by presence of opaque (op) and translucent (tr) colonies. Since cells derived from both colony types are infected by VP93 it is unlikely that resistance to the phage is associated with the op/tra character. However, resistance to phage could be related to another character associated with phase change. Attempts to find sensitive and resistant clones were not successful, this could be expected if the rate of exchange between sensitive to resistant bacteria and vice versa is similar to 0.01 per generation, in this case the colonies would have both types of bacteria even if they come from a single cell. This situation was successfully modeled using the Berkeley Madonna program, suggesting that the proposed explanation for the persistence of phage in the infected bacterial cuitures is accurate. In order to determine genes that may be involved in resistance to VP93 a mutant in the hsdR gene from type I restriction-modification system was generated. Bacterial restriction systems are involved in the defense against phages and it has been observed that their expression may be regulated by a phase change mechanism. However, the results obtained by infecting with VP93 the obtained mutants showed that their sensibility to the phage was not different to that of the wild strain. Finally we studied the effect of VP93 on the competitiveness of the pandemic strain of V. parahaemolyticus with other strains of the same species that cohabitate in shellfish. VP93 infects nearly 50% of the non-pandemic strains of V. parahaemolyticus isolated from shellfish, some with greater efficiency than the pandemic strain. When a co-culture of the pandemic strain PMC57.5 and the no pandemic strain PMA112 is infected with VP93, infection favors the prevalence of the pandemic strain. In the absence of phage PMA112 strain is present in a greater proportion of the culture, however, in presence of the phage is the pandemic strain prevails and the PMA112 strain becomes undetectable. Furthermore, when co-cultures of the pandemic strain PMC57.5 with a non-pandemic strain resistant to phage is infected with VP93, the proportion of each strain is not different to that observed in uninfected co-cultures. These resuits suggest that the interaction between VP93 and the pandemic strain of V. parahaemolyticus could be advantageous for both the phage and the bacteria. By not killing its host VP93 maintain the cells that reproduce it and the bacteria would be provided with a phage that can kill competing strains present in shellfish.