Estudio de la participación de una citocromo P450 reductasa (CPR) en la biosíntesis de Astaxantina en Xanthophyllomyces dendrorhous

Abstract

La levadura basidiomicete Xanthophyllomyces dendrorhous sintetiza carotenoides, principalmente la xantófila astaxantina que presenta un gran interés biotecnológico debido a su uso como suplemento alimenticio en la industria acuícola y por sus propiedades antioxidantes. En esta levadura, en la formación de astaxantina a partir de beta-caroteno participa una sola enzima; la astaxantina sintasa o CrtS (codificada por el gen crtS) que pertenece a la familia de las proteínas citocromo P450 monooxigenasas (P450), las que requieren de la citocromo P450 reductasa (CPR) como donador de electrones. En esta tesis se aisló y caracterizó por primera vez el gen crtR de la CPR de X. dendrorhous. Se determinó su organización estructural, su ubicación en el cariotipo electroforético de la levadura y además se construyó un modelo tridimensional de la proteína que codifica. Asimismo, se comprobó que este gen está involucrado en la biosíntesis de astaxantina. La funcionalidad de dicho gen se demostró mediante experimentos de transformación de X. dendrorhous. De esta manera se obtuvieron dos mutantes; CBSTr y T13, por reemplazo de una porción del gen crtR por un módulo de resistencia a higromicina B. CBSTr, proveniente de la cepa silvestre CBS-6938, forma colonias de color amarillo, ya que no puede producir astaxantina y acumula beta-caroteno y T13 es un transformante heterocigoto que forma colonias pálidas, debido a que produce menos astaxantina y más beta-caroteno en relación a su cepa parental UCD 67-385. Los resultados de esta tesis permitieron determinar por primera vez que el producto génico de crtR es esencial para la biosíntesis de astaxantina de X. dendrorhous. Adicionalmente, se estudió la expresión génica de los genes crtS y crtR (a nivel de sus RNA mensajeros) a lo largo del crecimiento de un cultivo de la levadura silvestre en un fermentador. A pesar que ambos genes codifican proteínas que participan en una misma etapa de la ruta de biosíntesis del carotenoide, se observó que su patrón de expresión es distinto, por lo que probablemente su regulación también es diferente. La biosíntesis de astaxantina de X. dendrorhous es un proceso complejo que podría estar regulado en distintos niveles. Sin embargo, para poder comprender la ruta de biosíntesis es importante conocer todos los genes estructurales de las enzimas que participan en esta vía. De esta manera, el aislamiento y caracterización de un gen que aun no ha sido descrito es una gran contribución para el conocimiento de la carotenogénesis de X. dendrorhous.

The basidiomycete yeast Xanthophyllomyces dendrorhous synthesizes carotenoids, primarily astaxanthin. Astaxanthin is a xanthophyll with a huge commercial interest due to its use as a nutritional supplement in the aquaculture industry and its antioxidant properties. Recently, it has been published that for the astaxanthin formation from betacarotene in this yeast, a single astaxanthin synthase enzyme or CrtS, encoded by the crtS gene, is required. This enzyme belongs to the cytochrome P450 monooxygenase protein family (P450), which requires the cytochrome P450 reductase (CPR) as an electron donor. In this thesis the crtR gene, which encodes for CPR from X. dendrorhous, was isolated and characterized for the first time. Its structural organization and its location in the yeast electrophoretic karyotype were determined. Also a three dimensional model of CrtR was constructed and the involvement of this protein in the astaxanthin biosynthesis was determined. Additionally, the functionality of crtR was demonstrated through X. dendrorhous transformation experiments. By this way two mutants; CBSTr and T13, were obtained by replacing a portion of the crtR gene with a hygromicin B resistance cassette. CBSTr, which comes from the wild type strain CBS-6938, forms yellow colonies as it can not produce astaxanthin and accumulates beta-carotene and T13 is a heterozygote transformant that forms pale colonies, because it produces less astaxanthin and more beta-carotene in relation to its parental strain UCD 67-385. The results of this thesis revealed for the first time that the crtR gene product is essential for in X. dendrorhous astaxanthin biosynthesis. Moreover, the expression of genes crtS and crtR was studied at the messenger RNA level along the growth curve of the wild type yeast culture in a fermenter. Despite the fact that both genes encode proteins involved in the same stage of the carotenoid biosynthetic route, it was noted that their expression pattern was different, suggesting a different regulation for each gene. Astaxanthin biosynthesis in X. dendrorhous is a complex process that could be regulated at different levels. However, in order to understand the biosynthetic route is important to know all the structural genes ofthe enzymes involved in this path. Thus, the isolation and characterization of a new gene involved in carotenogenesis is a significant contribution to the knowledge of this process in X. dendrorhous.