Estudio del metabolismo de las polifosfatos en la bacteria que degrada policlorobifenilos pseudomonas sp. B4: posibles implicancias en los ajustes fisiológicos de las bacterias ante la presencia de estos compuestos organoclorados

Abstract

Los compuestos organoclorados representan uno de los principales contaminantes orgánicos en el medio ambiente y dentro de estos, particularmente los policlorobifenilos (PCBs) constituyen un problema medioambiental de preocupación debido a sus propiedades recalcitrantes a la degradación, su bioacumulación y toxicidad. La bioremediación bacteriana constituye una estrategia promisoria para la limpieza de los ambientes acuáticos y terrestres contaminados con PCBs. Cuando los microorganismos son sometidos a condiciones de estrés, acumulan polifosfatos inorgánicos (poliP). La biosíntesis de poliP depende de la polimerización del fosfato terminal del ATP mediante la enzima polifosfato quinasa (PPK1), mientras que la enzima exopolifosfatasa (PPX) es responsable de su hidrólisis. Actualmente, existen numerosas evidencias sobre el papel de los poliP en la regulación de la respuesta de las bacterias frente a cambios ambientales y durante la fase estacionaria de crecimiento. Teniendo en cuenta la toxicidad de los PCBs para las bacterias que los degradan y el papel de los poliP en los ajustes celulares a las condiciones de carencia y estrés, estudiamos los cambios en el metabolismo de los poliP y su influencia en procesos celulares importantes para la bioremediación de los PCB como la motilidad, quimiotaxis y formación de biopelículas en la bacteria degradadora de bifenilo Pseudomonas sp. B4. Durante el desarrollo de esta T'esis se determinó en Pseudomonas sp. B4 la presencia de gránulos densos a los electrones, crecidas en diferentes fuentes de carbono y en diferentes etapas del crecimiento así como sus variaciones ante traspasos a distintos medios de cultivo. Observamos que Pseudomonas sp. B4 acumula una gran cantidad de estos gránulos cuando crecen en todas las fases de crecimiento en bifenilo, y en glucosa sólo cuando las células entran en la fase estacionaria del crecimiento. Mediante el análisis de difracción de rayos-X acoplado a microscopía electrónica demostramos que los gránulos densos a los electrones acumulados por Pseudomonas sp. B4, durante su crecimiento en bifenilo como única fuente de carbono, están compuestos principalmente por fosfato y muy probablemente por poliP. Esto se corroboró mediante el empleo de un método enzimático específico para la determinación cuantitativa de los poliP en las células crecidas en las diferentes condiciones. En esta Tesis sugerimos que estos cambios en los niveles de poliP constituyen un ajuste del metabolismo ante condiciones estresantes para la célula, lo que fue comprobado por el aumento de los niveles tanto de una proteína de estrés general (GroEL) como de las especies reactivas del oxígeno (ROS) cuando las células se enfrentaron a bifenilo y clorobifenilos como únicas fuente de carbono y energía. Es posible que junto a la respuesta frente a las carencias nutricionales, los gránulos de poliP en Pseudomonas sp. B4 sean también una respuesta adaptativa al estrés oxidativo generado durante la degradación de estos compuestos. La capacidad de las células de Pseudomonas sp. B4 para detectar estos riesgos tempranamente les permitiría acumular poliP como un sistema de alarma y así activar o aumentar los sistemas de protección. Para explorar más detalladamente el papel de los poliP en Pseudomonas sp. B4 se obtuvieron células recombinantes incapaces de acumular este biopolímero debido a la sobrexpresión de la exopolifosfatasa (PPX1) de Saccharomyces cerevisiae mediante el uso de dos vectores de expresión de amplio espectro. La sobreexpresión de la PPX1 nos permitió contar con células incapaces de acumular poliP (poliP-) y de esa forma poder conocer más detalladamente cuál es la función de este biopolímero en los procesos celulares de Pseudomonas sp. B4 y particularmente en aquellos relacionados con su crecimiento en bifenilo. Estas células de Pseudomonas sp. B4 incapaces de acumular poliP resultaron deficientes en numerosas procesos celulares, como la motilidad y la quimiotaxis y también en la capacidad de formar biopelículas y en la división celular. También su crecimiento en bifenilo es más lento y alcanza un menor número de células que el cultivo control. Es quizás una combinación de estas incapacidades fisiológicas lo que podría afectar el crecimiento de Pseudomonas sp. B4 poliP- en bifenilo. Frente a la ausencia de poliP, unido a una capacidad ineficiente para utilizar el bifenilo como única fuente de carbono, es probable que la bacteria responda dirigiendo tempranamente el metabolismo hacia la fase estacionaria. Esto respaldaría la importancia de los poliP en Pseudomonas sp. B4 cuando crece en bifenilo y clorobifenilos. El poliP puede contribuir a la coordinación de la respuesta frente a las condiciones desfavorables de crecimiento en estos contaminantes organoclorados. Finalmente, y para tener un estudio preliminar a escala global de la función de los poliP en Pseudomonas sp. B4, analizamos comparativamente los cambios que tienen lugar en el proteoma de las bacterias poliP- con respecto a las células controles. Aunque sólo analizamos una condición de crecimiento y secuenciamos sólo aquellas proteínas cuya expresión cambió en mayor magnitud los resultados nos permitieron encontrar nuevas pistas sobre el papel de los poliP en las bacterias. Los cambios en el proteoma de Pseudomonas sp. B4 nos permitieron establecer una relación entre los poliP, el ciclo de Krebs y la síntesis de alginato. También encontramos cambios en algunas enzimas relacionadas con la síntesis de los aminoácidos y el estrés oxidativo, aspectos importantes que se refieren a la función energética y regulatoria de los poliP en Pseudomonas sp. B4.

Organochlorine compounds represent one of the main polluting agents in the environment and particularly polychlorinated-biphenyls (PCBs) constitute an unsolved problem due to their recalcitrant properties to degradation, their bioaccumulation and high toxicity to living organisms. Bacterial bioremediation constitutes a promissory strategy for the cleaning of aquatic and terrestrial environments contaminated with PCBs. When microorganisms are under stressing conditions, they accumulate inorganic polyphosphate (polyP). Poly P is a linear polymer of many tens or hundreds of orthophosphate (Pi) residues linked by high-energy phosphoanhydride bonds. The biosynthesis of polyP depends on the polymerization of the terminal phosphate of ATP through the action of polyphosphate kinase 1 (PPK1) whereas the enzyme exopolyphosphatase (PPX) is responsible for its hydrolysis. At the moment, numerous evidences exist on the role of polyP in the regulation of the bacterial response to environmental changes and during the stationary phase of growth. Considering that PCBs are also toxic for the bacteria capable to degrade them and the functions of polyP in the cellular adjustments to conditions of deficiency and stress, we studied the changes in polyP metabolism and its influence in important cellular processes for PCB bioremediation such as motility, chemotaxis and biofilm formation abilities in the highly motile biphenyl-utilizing bacteria Pseudomonas sp. B4. Electrondense granules were observed in Pseudomonas sp. B4 when grown in different carbon sources and different stages of growth. Particularly, we observed that Pseudomonas sp. B4 accumulated a great amount of these granules only when grown in biphenyl in all phases of growth and in glucose only when the cells entered in the stationary phase growth. By means of X-ray diffraction analysis methods (EDAX and EELS) connected to electron microscopy (EM) we demonstrated that the granules accumulated by Pseudomonas sp. B4 during growth in biphenyl as the sole carbon source were composed mainly by phosphate and most likely by polyP. This was confirmed by using a specific enzymatic method for the quantitative determination of polyP in the cells observed by EM. In this Thesis we suggested that the changes in the levels of polyP are an adjustment of the cell metabolism to stressing conditions generated during PCBs degradation. This was verified by the increase of the general stress protein (GroEL) and reactive oxygen species (ROS) when cells where in the presence of biphenyl and chlorobiphenyls as the sole carbon and energy sources. In addition to the role of polyP in nutritional deficiencies, the accumulation of polyP in Pseudomonas sp. B4 may also be an adaptive response to the oxidative stress generated during the degradation of these compounds. By sensing any cellular stress, even at an early stage of growth, Pseudomonas sp. B4 can sound an alarm by accumulating polyP, which will then activate or augment several protective systems. To further explore the role of polyP in Pseudomonas sp. B4 we obtained recombinant cells unable to accumulate this biopolymer. This was achieved by the overexpression of the exopolyphosphatase (PPX1) from Saccharomyces cerevisiae with two wide-range expression vectors. This overexpression of PPX1 allowed us to obtain cells in which more than 95% of the cellular polyP was removed. Psoudomond Pseudomonas sp. B4 incapable of accumulating polyP (polyP-) were deficient in numerous cellular processes such as motility, chemotaxis, cellular division and in the ability to form biofilm. In addition, it was affected on its growth in biphenyl as the sole carbon source. It is perhaps a combination of these physiological incapac ities that could affect the growth of Psendomonas sp. B4 (polyP-) in biphenyl. The abstence of polyP, confirmed by EM and quantification of the biopolymer, toether with the inefficient use of the insoluble carbon source, constitute a cellar retsponse directing metabolism towards the stationary phase of growth. The sultss obtained endorse the importance of polyP when Pseudomonas sp. B4 is growi in biphenyl and chlorobiphenyl as the sole carbon and energy sources. PolyP pcbably coordinates their answer to the unfavorable growth conditions in these organochlorinated compounds. Finally, to have a preliminary global view of the role of polyP in Pseudomonas sp. B4, we analyzed comparatively the changes taking place in the proteome of the polyP- cells as compared with control cells. Although we analyzed only one condition of growth and sequenced only those proteins whose expression changed in a greater magnitude, the results obtained allowed us to discover new findings of the role of polyP in bacteria. We found a relationship between polyP, the Krebs cycle and the synthesis of alginate. We also found changes in enzymes involved in amino acids synthesis and oxidative stress, both important aspects that confirm the role of polyP not only in energy supply but also in the coordination of cellular responses in Pseudomonas sp. B4.