Estudio de la vía metabólica de la galactosa en acidithiobacillus ferrooxidans ATCC 23270

Abstract

Los microorganismos son usados comercialmente para extraer cobre, zinc, uranio, níquel y cobalto a partir de los sulfuros metálicos respectivos, proceso conocido como biolixiviación. Uno de los microorganismos más estudiados involucrado en el proceso de biolixiviación es Acidithiobacillus ferrooxidans, anteriormente denominado Thiobacillus ferrooxidans. A. ferrooxidans es una y-proteobacteria quimiolitoautotrófica que obtiene la energía y los electrones por la oxidación de compuestos reducidos de azufre a sulfato y de Fe II a Fe III. Esta bacteria es mesófila, aerobia facultativa y capaz de fijar CO2 y N2 atmosférico para obtener el carbono y el nitrógeno celular. La unión y adherencia de A. ferrooxidans a la superficie del mineral, con la subsiguiente formación de biopelículas, son prerrequisitos para que la disolución del metal ocurra, tanto en operaciones industriales como en ambientes naturales. La formación de biopelículas está acompañada de la producción de polisacáridos extracelulares (EPS). Mientras que el papel de la formación de biopelículas de A. ferrooxidans en la solubilización de metales ha sido ampliamente estudiada, poco se sabe de la genética subyacente, la bioquímica y la regulación de formación EPS por este microorganismo. Esta carencia de información propició los estudios realizados en esta tesis. en esta En la bacteria autótrofa A. ferrooxidans se ha identificado un loci de cinco genes pertenecientes a la vía de Leloir, cuya función propuesta es la de generar los precursores para la síntesis de EPS. El orden de los genes es luxA-galE-galK-pgm-galM y codifican para las proteínas LuxA, UDP-glucosa 4-epimerasa, galactoquinasa, fosfoglucomutasa y galactosa mutarotasa, respectivamente. Los genes de este loci forman parte de una sola unidad transcripcional, por lo tanto estarían formando parte de un operón. En el genoma de la bacteria se identificaron otros dos genes pertenecientes a la vía de Leloir y que no forman parte de este operón, galU potencialmente codificando la UDP-glucosa pirofosforilasa y el probable gen galT que codificaría para una galactosa-1-fosfato uridiltransferasa. Usando RT-PCR semicuantitativo, se demostró que los genes del operón gal pueden ser expresados en mayor nivel durante el crecimiento en el medio de hierro comparado al crecimiento en el medio de azufre. Las funciones de galE, pgm, galU y galT fueron validadas por complementación de las mutantes de los respectivos genes homólogos en Escherichia coli y por ensayos de medición de la actividad enzimática. Los datos sugieren que A. ferrooxidans es capaz de sintetizar los precursores de EPS, UDP-glucosa y UDP- galactosa. Además, la presencia de los genes rfbA, B, Cy D sugiere que también puede sintetizar dTDP-ramnosa, otro precursor para la síntesis del EPS. Por análisis bioinformático se identificaron en el genoma de A. ferrooxidans los genes y las vías metabólicas involucradas en la síntesis del EPS. Por RT-PCR se comprobó que un loci de genes involucrados en la síntesis de los precursores del EPS, está formando parte de dos operones independientes. El primer operón esta implicado en la síntesis del anclador lípidico sobre el cual las unidades repetitivas del EPS son ensambladas, e incluye el gen uppS, potencialmente codificando la undecaprenil fosfato sintetasa, juntos con los genes asociados a la formación del anclador cdsA, dxr y pirH. Este operón es expresado en mayor nivel cuando las células son cultivadas en el medio que contiene sulfato de hierro comparado con el medio en azufre. El segundo operón predicho está implicado en la síntesis de los lipopolisácaridos (LPS). Además, se identificaron los genes candidatos wza, wzb, wzc, wzx y wzy. En otros organismos los productos de estos genes están formando el complejo "flippase" que está implicado en la inversión, polimerización y exportación de precursores EPS a través de la membrana interna con la regeneración simultánea del anclador lípidico. El efecto de la galactosa sobre la formación de biopelículas de A. ferrooxidans en pirita fue evaluado por microscopía de fuerza atómica y de fluorescencia, comparando las biopelículas generadas por la bacteria en presencia y ausencia de galactosa exógena. El análisis de los genes y de las vías metabólicas propuestas sugiere que la bacteria puede usar varios caminos para la síntesis del EPS, mediante los cuales el organismo puede integrar la formación de las biopelículas con el metabolismo central del carbono. Esto le permitiría regular la composición del EPS según las exigencias fisiológicas y ambientales. Debido a que el EPS es el componente principal de una biopelícula, se espera que este estudio proporcione un modelo inicial de las vías metabólicas implicadas en la formación del EPS en A. ferrooxidans, lo que ayudará en el entendimiento del papel de las biopelículas en el proceso de biolixiviación y en la biominería.

Microorganisms are used commercially to extract copper, zinc, uranium, nickel and cobalt from low-grade or difficult-to-process sulfide ores or mineral concentrates by a process known as bioleaching. One of the most studied microorganisms involved in bioleaching is Acidithiobacillus ferrooxidans, formerly called Thiobacillus ferrooxidans. A. ferrooxidans is a chemolithoautotrophic, Yproteobacterium that obtains energy and electrons by the oxidation of reduced sulfur compounds to sulfate or FelI to FelII. It is a mesophilic, facultative aerobe that fixes atmospheric CO2 and N2 to provide cellular carbon and nitrogen. The attachment and adherence of A. ferrooxidans to mineral surfaces and the subsequent formation of biofilms are prerequisites to mineral dissolution, both in industrial operations and in natural environments. Biofilm formation is accompanied by the production of extracellular polysaccharides (EPS). Whereas the role of biofilm formation by A. ferrooxidans in metal solubilization has been actively studied, little is known regarding the underlying genetics, biochemistry and regulation of EPS formation by this microorganism. This lack of information prompted the studies reported in this thesis. A cluster of five genes, proposed to be involved in the formation of extracellular polysaccharide (EPS) precursors via the Leloir pathway, have been identified in the acidophilic, autotroph A. ferrooxidans. The order of the genes is luxA-galEgalK-pgm-galM encoding a LuxA-like protein, UDP-glucose 4-epimerase, galactokinase, phosphoglucomutase and galactose mutarotase, respectively. The gal cluster forms a single transcriptional unit and is therefore an operon. Two other putative genes of the Leloir pathway, galU potentially encoding UDP-glucose pyrophosphorylase and a galT-like gene that may encode a galactose-1-phosphate uridylyltransferase-like activity were found unlinked in the genome. Using semiquantitative RT-PCR, the genes of the gal operon were shown to be expressed more during growth in iron medium compared to growth in sulfur medium. The functions of galE, pgm, galU and the galT-like gene were validated by complementation of Escherichia coli mutants and by in vitro enzyme assays. The data suggest that A. ferrooxidans is capable of synthesizing the EPS precursors UDP-glucose and UDPgalactose. In addition, genes rfbA,B,C and D were identified in the genome of A. ferrooxidans suggesting that it can also synthesize the EPS precursor dTDPrhamnose. Genes and metabolic pathways potentially involved in the formation of extracellular polysaccharides (EPS) from modified nucleotide sugar precursors were also identified by bioinformatic analysis in the genome of A. ferrooxidans. Two independent clusters of genes predicted to be involved in the synthesis of EPS precursors were each shown to be transcriptional units or operons by RT-PCR analysis. The first operon is suggested to be involved in the synthesis of the lipid anchor on which the repeating units of the EPS are assembled and includes uppS, potentially encoding undecaprenyl pyrophosphate synthetase, together with the associated anchor formation genes cdsA, dxr and pirH. This operon is expressed more when cells are grown in medium containing iron sulfate versus sulfur. The second operon is predicted to be involved in the synthesis of lipopolysaccharides. In addition, putative genes wza, wzb, wzc, wzx and wzy were identified. In other organisms it has been shown that the products of these genes form the "flippase" complex that is involved in the inversion, polymerization and exportation of EPS precursors through the inner membrane with the concurrent regeneration of the lipid anchor. Given the similarity of the putative Wzabcxy proteins of A. ferrooxidans with predicted orthologs, we speculate that they also form the flippase complex in this organism. A possible role for galactose in the biosynthesis of EPS and in subsequent biofilm formation was suggested and was supported by fluorescence microscoрy examination and atomic force microscopy of biofilms produced on pyrite in the presence or absence of exogenous galactose. Analysis of the proposed genes and metabolic pathways suggests various ways in which the organism can integrate biofilm formation with central carbon metabolism and how it might be able to regulate biofilm composition according to physiological and environmental requirements Since EPS constitute the major bulk of biofilms, it is hoped that this study will provide an initial model for the metabolic pathways involved in EPS formation in A. ferrooxidans and will aid in understanding the role of biofilms in mineral leaching and the formation of acid mine drainage.