Estudio de los genes CYC8 y TUP1 de Xanthophyllomyces dendrorhous y su participación en represión catabólica y regulación de la carotenogénesis

Abstract

Xanthophyllomyces dendrorhous es una levadura productora de astaxantina, carotenoide de interés comercial debido a su uso en la industria acuícola y farmacéutica. Actualmente, se conoce la ruta de biosíntesis de astaxantina y el perfil de expresión de sus genes. Si bien aún se desconocen los mecanismos regulatorios de dicho proceso, diversos estudios han demostrado que la presencia de glucosa reprime la carotenogénesis en X. dendrorhous. Adicionalmente, en nuestro laboratorio se ha caracterizado genética y funcionalmente el regulador Mig1, comprobándose que éste reconoce secuencias en las regiones promotoras de algunos genes carotenogénicos. En otras levaduras, el regulador Mig1 requiere del complejo co-represor Cyc8-Tup1 para ejercer la represión sobre los genes blanco, siendo este mecanismo altamente conservado en eucariontes y conocido como represión catabólica. El objetivo general de este trabajo fue estudiar el mecanismo de regulación de la carotenogénesis por represión catabólica en X. dendrorhous, enfocándose en la función del complejo co-represor Cyc8-Tup1. En primera instancia, se caracterizaron los genes CYC8 y TUP1 de X. dendrorhous y se determinó la secuencia de sus ORFS. Mediante análisis bioinformático se determinó que codifican los componentes del complejo Cyc8-Tup1 descrito previamente en otros organismos como S. cerevisiae. Para estudiar la funcionalidad de los genes CYC8 y TUP1 se obtuvieron cepas mutantes de dichos genes derivadas de la cepa silvestre UCD 67-385 de X. dendrorhous y se evaluó su efecto en el crecimiento, represión mediada por głucosa de la actividad invertasa extracelular, producción de carotenoides y en la expresión a nivel de los transcritos de distintos genes involucrados en carotenogénesis (HMGR, idi, FPS, crtE, crtYB, crtl, crtS y crtR). Como resultado, se observó que ambas cepas mutantes tienen una tasa máxima de crecimiento menor que la cepa silvestre y la producción de carotenoides es un 90% (en mutante cyc8) у 40% (en mutante tup1) mayor en comparación a la cepa silvestre al cultivarlas con glucosa como única fuente de carbono. En concordancia, se observó que el efecto represor de la glucosa sobre la síntesis de carotenoides prácticamente se pierde en las mutantes cycs y tup1. Además, el efecto de la glucosa sobre los niveles de transcrito de los distintos genes estudiados es diferente en las mutantes en comparación a la cepa silvestre, destacándose genes involucrados en la síntesis de precursores de los carotenoides como HMGR, idi y FPS. Paralelamente, se realizaron ensayos de complementación heteróloga mediante la expresión de los genes CYC8 y TUP1 de X. dendrorhous en cepas de S. cerevisiae mutantes de los genes respectivos. Se observó que los genes de X. dendrorhous complementan parcialmente dichas mutaciones, utilizando como criterio la tasa de crecimiento y la represión mediada por glucosa de la actividad invertasa extracelular. Por otra parte, se realizó un análisis bioinformático de los transcriptomas de las cepas silvestre UCD 67-385, cyc8 y tupf de X. dendrorhous, obtenidos a partir de cultivos en que se utilizó glucosa, maltosa o succinato como única fuente de carbono. De esta manera se distinguieron 166 y 93 ORFs mayormente representados (basado en su valor de RPKM) en los transcriptomas de cultivos con glucosa de las cepas cycs8 y tupt, respectivamente, en comparación a la cepa silvestre. Los genes identificados estarían involucrados principalmente en procesos de transporte transmembrana, metabolismo de carbohidratos, regulación de la transcripción y metabolismo de lípidos. En concordancia, mediante análisis bioinformático se logró identificar posibles genes que codificarían los reguladores Rox1, Skn7, Yap6, Crt1, Opi1 y Rgt1 que similar a Mig1, reclutarían el complejo Cyc8-Tup1 a los promotores de los distintos grupos de genes blanco. Finalmente, de acuerdo a los resultados obtenidos, en este trabajo se concluyó que los genes CYC8 y TUP1 de X. dendrorhous identificados, son funcionales y estarían involucrados en la regulación de diferentes procesos biológicos. Mediante su participación en el mecanismo de represión catabólica, los genes CYC8 y TUP1 contribuyen en la regulación de la carotenogénesis en X. dendrorhous.

Xanthophyllomyces dendrorhous is an astaxanthin producer yeast, a carotenoid of commercial interest because of its use in aquaculture and pharmaceutical industry. Currently, the carotenogenic pathway and the expression profile of the genes involved are known. Even though the regulatory mechanisms of this process are still unknown, several studies have shown that glucose represses carotenogenesis in X. dendrorhous. Also, in our laboratory the regulator Mig1 was genetic and functionally characterized, proving that it recognize specific sequences in the promoter region of some carotenogenic genes. In other yeasts, Mig1 requires the corepressor complex Cyc8-Tup1 to repress the target genes, this mechanism is highly conserved in eukaryotes and is known as catabolite repression. The general aim of this work was to study the carotenogenesis regulatory mechanism by catabolite repression in х. dendrorhous, focusing on the role of the corepressor complex Cyc8-Tup1. First, the X. dendrorhous CYC8 and TUP1 genes were characterized and their ORFs sequences were identified. By bioinformatic analysis, it was determined that these genes encode the components of Cyc8-Tup1 complex previously described in other organisms like S. cerevisiae. To evaluate the CYC8 and TUP1 genes functionality, mutant strains deriving from the wild-type strain UCD 67-385 of X. dendrorhous of the corresponding genes were constructed. The effect of these mutations on growth, extracellular invertase activity repression, carotenoid production and the expression of different genes involved in carotenogenesis (HMGR, idi, FPS, crtE, crtYB, crtl, crtS y crtF) at their transcripts level, was evaluated. Both mutant strains had a slower growth rate than the wild-type and carotenoid production was 90% (in the cyc8 mutant) and 40% (in the tup1 mutant) higher compared to wild-type when culture with glucose as sole carbon source. Accordingly, it was observed that the repressive effect of glucose on carotenoid synthesis was practically lost in the cycs and tupf mutants. Furthermore, the effect of glucose on the transcript levels of the studied genes was different in the mutants strains compared to wild-type, particularly in those genes involved in the synthesis of carotenoids precursors such as HMGR, idi and FPS. In parallel, heterologous complementation assays were performed by expressing the X. dendrorhous CYC8 and TUP1 genes in S. cerevisiae mutants strains of the corresponding genes. It was observed that both X. dendrorhous genes partially complement the corresponding mutations, using as a criterion the growth rate and the extracellular invertase activity glucose mediated repression. Moreover, the transcriptomes of the wild-type (UCD 67-385), tupt and сусв Х. dendrorhous strains, obtained from cultures using glucose, maltose or succinate as the sole carbon source, were analyzed. By this way (based on RPKM value), 166 and 93 ORFs were mainly represented in the cycs and tupf strains transcriptomes, respectively, compared to the wild-type when cultured with glucose. The identified genes are principally involved in transmembrane transport, carbohydrate metabolism, regulation of transcription and lipid metabolism. Accordingly, by bioinformatic analysis it was possible to identify potential genes encoding the Rox1, Skn7, Yap6, Crt1, Opi1 and Rgt1 regulators, which like Mig1, would recruit the Cyc8-Tup1 complex to the promoter region of the different groups of target genes. Finally, in this work we were able to conclude that the identified CYC8 and TUP1 X. dendrorhous genes are functional and involved in the regulation of different biological processes. These genes participate in the catabolite repression mechanism and in this way, they contribute to the X. dendrorhous carotenogenesis regulation.