Estudio del mecanismo de inicio de la traducción de los MRNAS que codifican para las proteínas HBZ, del virus de la leucemia de linfocitos T humano de tipo 1 (HTLV-1)

Abstract

El virus de la hepatitis C (VHC) es un virus de RNA de hebra positiva con envoltura, que pertenece al género Hepacivirus de la familia Flaviviridae. La infección por VHC frecuentemente es crónica, siendo la principal causa de carcinoma hepatocelular y de transplante de hígado entre adultos de países occidentales. Actualmente no existe un tratamiento eficaz ni vacuna para prevenir la infección causada por el virus. Además, su estudio y la generación de nuevos tratamientos se han visto limitados por la falta de un sistema eficiente de replicación del virus. El VHC es principalmente hepatotrópico, sin embargo, hay considerable evidencia de la existencia de sitios de replicación extrahepáticos, como por ejemplo las células mononucleares de sangre periférica (PBMC). El VHC se caracteriza por poseer un alto grado de heterogeneidad genética, lo cual resulta en la existencia de diversos genotipos y subtipos. En Chile, el genotipo predominante es el 1b, el cual presenta una alta resistencia a la terapia antiviral y confiere un riesgo mayor para desarrollar carcinoma hepatocelular. Además, en nuestro país la mayoría de los pacientes han adquirido el virus a través de transfusiones de sangre, rara vez están co-infectados con el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) y debido al alto costo de la terapia generalmente no han sido sometidos a tratamiento antiviral. Estos antecedentes le otorgan a la población Chilena infectada con VHC características únicas; por tanto, consideramos importante caracterizar el virus circulante en esta población y establecer la existencia de posibles reservorios extra-hepáticos para el virus VHC. Con este objetivo, se evaluó la prevalencia de RNA de VHC en PBMC y plasma de pacientes chilenos crónicamente infectados con el virus. En los individuos analizados, en la mayoría se detectó RNA viral en PBMC (73%). Los resultados de ensayos de conformación de polimorfismo de hebra simple (SSCP) y de secuenciación de los 5'UTR, mostraron que existen diferencias entre las cuasiespecies virales presentes en plasma y en PBMC; en consecuencia, se generó nueva evidencia que apoya la hipótesis que los PBMC podrían representar un reservorio viral y que sólo ciertas cuasiespecies de VHC circulantes en plasma están presentes en PBMC. Con el propósito de determinar si las cuasiespecies virales recuperadas desde plasma y PBMC presentan capacidades similares de replicación, se procedió a estudiar el inicio de la síntesis de proteínas del mRNA de VHC, debido a que es uno de los pasos limitantes en el ciclo replicativo del virus. El inicio de la traducción de VHC es mediado por un sitio interno de entrada del ribosoma (IRES), el cual recluta la subunidad 40S ribosomal sin utilizar los factores de iniciación canónicos; esta característica del mRNA de VHC lo hace único entre los mRNA eucarióticos e incluso entre los mRNA de origen viral que contienen IRES. Por lo tanto, con el objetivo de establecer las eficiencias traduccionales de IRES de VHC aislados desde virus presentes en plasma y PBMC de pacientes chilenos con infección crónica por este virus; los IRES se clonaron en un vector bicistrónico dual luciferasa, se transcribieron in vitro y los RNA bicistrónicos se utilizaron en experimentos de traducción in vitro. Nuestros resultados indican que la mayoría de los IRESs aislados desde las muestras clínicas corresponden al genotipo 1b y presentan actividad traduccional semejante al control positivo, el IRES 1b nativo. Sin embargo, algunos aislados presentaron diversas mutaciones y una actividad traduccional reducida al compararlas con el IRES 1b. Con el fin de establecer si las mutaciones identificadas afectan la actividad traduccional del IRES de VHC, se procedió a realizar experimentos de mutagénesis sitio dirigida introduciendo cada una de ellas o en combinación en el IRES nativo 1b. Utilizando esta aproximación, se identificaron diversas mutaciones puntuales capaces de inhibir la actividad traduccional del IRES de VHC. Las mutaciones que inhibieron más drásticamente la eficiencia traduccional del IRES se localizaron en el dominio IIId, región que está involucrada en la unión de la subunidad 40S ribosomal, por lo cual se procedió a estudiar con mayor detalle las mutaciones G266A, G268U y la doble mutación G266A/G268U. Con el propósito de determinar si estas mutantes producen una inhibición de la actividad traduccional del IRES debido a un cambio estructural de esta región, se realizaron estudios bioinformáticos de simulación de dinámica molecular y se estudió la estructura del RNA del dominio IIld mediante dicroísmo circular. En conjunto; los resultados generados en este trabajo de tesis permiten concluir que a diferencia de lo propuesto para la mayoría de los IRES virales cuya actividad es dependiente sólo de su estructura, la actividad traduccional del IRES de VHC es dependiente tanto de la estructura como de la secuencia primaria del dominio IlId. Además, los resultados permiten sugerir que la secuencia primaria de la región del dominio IIId participa en la interacción especifica con elementos requeridos para la iniciación de la traducción del mRNA viral de VHC, y por lo tanto, puede ser considerado como un blanco terapéutico para el desarrollo de nuevos antivirales que inhiban esta interacción. Adicionalmente, nuestros resultados indican que en la mayoría de los pacientes analizados (69%) se encuentran diferencias en las eficiencias traduccionales entre los IRES aislados desde el plasma y los obtenidos desde PBMC. Esta observación sugiere que en gran parte de los individuos infectados VHC es capaz de infectar diferentes compartimentos biológicos.

Hepatitis C virus (HCV) is an enveloped; positive single-stranded RNA virus of the Flaviviridae family, classified within the Hepacivirus genus. HCV is a significant etiologic agent of chronic liver disease and is the most frequent indication for liver transplantation in adults in western countries. To date, there is no effective treatment or vaccine against HCV. The search for and validation of novel HCV drugs is severely hampered by the lack of a robust cellular system that supports virus replication. These facts qualify HCV as a human pathogen of extreme medical significance. HCV is primarily hepatotropic, but there is mounting evidence suggesting the possibility of extrahepatic virus replication such as in peripheral blood mononuclear cell (PBMCs). HCV is characterized by a high degree of genetic heterogeneity resulting in the existence of various genotypes and subtypes. In Chile, the HCV genotype 1b is predominant among the infected population, the implication of these observations may be important as genotype 1b infections shows higher resistance to antiviral therapy and confers grater risk for development of hepatocellular carcinoma. Given this scenario, we were intrigued by the possibility of an extrahepatic reservoir for HCV since no study had been conducted to address this issue among the infected Chilean population who have mostly acquired the virus through blood transfusions, are rarely co-infected with human immunodeficiency virus (HIV), and due to the high cost of antiviral therapy are generally naive to treatment. With this purpose, we evaluated the prevalence of HCV RNA in plasma and PBMC of Chilean patients chronically infected with the virus. The bulk of patients harbored detectable amounts of viral RNA in PBMCs (73%) suggesting that infection of these cells is a frequent event among chronically infected HCV patients. Single-strand conformation polymorphism (SSCP) analysis and 5'UTR sequencing revealed the existence of clear HCV quasispecies differences between plasma and PBMC. In consequence, this work generated new evidence to support the notion that only certain HCV quasispecies are capable to be present in PBMC and the possibility that PBMC is a viral reservoir. In order to determine whether the viral quasipecies recovered from plasma and PBMC of patients presents similar capacity of replication, the study focused on mRNA translation, because this process is considered one of the limiting steps in the HCV replicative cycle. Translation initiation of the viral mRNA is mediated by an internal ribosome entry site (IRES), which recruits the 40S ribosomal subunit in a cap-independent fashion without the need of any canonical initiation factor; this feature exhibited by the HCV IRES makes it unique among eukaryotic mRNA and mRNAS from viral origin that harbor IRES elements. Therefore, in order to study the translational efficiencies of HCV IRES isolated from plasma and PBMC of Chilean patients with chronic infection by this virus; IRES isolated were cloned in a dual luciferase bicistronic vector; in vitro transcripted and the bicistronic RNAs generated from these constructs were used in in vitro translation experiments. Results show that the majority of the IRES isolated from clinical samples corresponds to the genotype 1b and present translational activity similar to the positive control, the wild type 1b IRES. However, IRESs which exhibited a translational activity lower than the wild-type 1b IRES were also isolated. We next sought to establish the relation between nucleotide substitution and IRES activity. Thus, we introduced the identified mutations in the 1b wild type background by site-directed mutagenesis. Using this approach, we successfully identified a number of nucleotide substitutions that correlated with a reduced IRES activity. Mutations that inhibited most dramatically the IRES translational efficiency were located in the stem-loop IIId that is involved in the binding of 40S ribosomal subunit, therefore we proceeded to study in greater detail the mutations G266A, G268U and the double mutation G266A/G268U. To determine whether these mutants produce an inhibition of IRES translational activity due to a structural change in this region, bioinformatics studies of molecular dynamics simulation and RNA structure of domain IIId by circular dichroism were conducted. Bioinformatics studies strongly suggested that indeed stem-loop IIIP harbouring the double mutation was similar to stem-loop IIId from the wild type 1b HCV-IRES. Encouraged by these findings we conducted a series of circular dicroism analysis of stem-loop IIId. We concluded that stem-loop IIId from both the double mutant and the wild type 1b IRES are similar under all tested experimental settings. Thus, our results support the notion that HCV-IRES activity is not only dependent on the overall RNA structure of stem-loop IIId but also the primary sequence of this domain plays an important role in HCV IRES-mediated translation initiation. Therefore, we propose that stem loop IIId meets the needed standards to be considered as a therapeutic target for the development of new antiviral molecules. In addition, our results indicate differences between the IRES translational efficiencies isolated from plasma and PBMC in the majority of individuals tested (69%). This observation suggests that HCV is capable of infecting different biological compartments.