Polifosfatos inorgánicos en el dominnio archaea : estudio en el género Sulfolobus

Abstract

El Dominio Archaea es uno de las tres divisiones fundamentales en los que se agrupan los seres vivos. Incluye microorganismos conocidos como extremófilos, como los termoacidófilos Sulfolobus acidocaldarius, S. solfatariucs y S. metallicus capaces de crecer a pH 1.5-3 y a temperaturas de 70 a 80°C. Como modelo del dominio Archaea y debido a sus potenciales usos en biotecnología, existe un gran interés por dilucidar los mecanismos por los cuales estos microorganismos se adaptan y responden a su medio ambiente. Cuando los microorganismos son sometidos a condiciones estresantes, acumulan polifosfatos inorgánicos (poliP). La única vía actualmente establecida para la biosíntesis de poliP es la polimerización del fosfato terminal del ATР mediante la enzima polifosfato quinasa (PPK) mientras que la enzima exopolifosfatasa (PPX) es responsable de su hidrólisis. Actualmente, existen fuertes evidencias sobre el rol de los poliP en la regulación de la respuesta de Escherichia coli frente a cambios ambientales y durante la fase estacionaria de crecimiento. En nuestro laboratorio, se han analizado las respuestas moleculares globales de S. acidocaldarius frente al shock térmico y la falta de fosfato y se han observado gránulos clásicamente descritos como poliP. Esta observación y la descripción por otro laboratorio de una proteína con actividad PPK y glicosil transferasa (GT) en S. acidocaldarius sugerían la existencia de poliP en este microorganismo, por lo que se propuso caracterizar los componentes genéticos del metabolismo de los poliP en el género Sulfolobus en relación con la respuesta a factores ambientales. Durante el desarrollo de esta tesis se detectó la presencia de poliP en S. acidocaldarius y S. solfataricus mediante un método cuantitativo y se caracterizaron el gen responsable de la supuesta actividad PPK y un gen ppx presente en el genoma de S. solfataricus. Se encontró que los niveles de poliP aumentan hacia la fase estacionaria de crecimiento y en carencia de ciertos nutrientes como los aminoácidos. La proteína de 60 kDa (P60) asociada al glicógeno cuyas actividades PPK y GT se habían descrito, resultó tener una alta similitud con glicógeno sintasas de arqueas y bacterias y mostró actividad GT. Sin embargo, no presentó ninguna similitud con PPKs conocidas y la actividad PPK fue muy baja. Se procedió a caracterizar los supuestos poliP sintetizados por el complejo glicógeno-proteína mediante extracción por gradientes de CsCl, hidrólisis mediada por PPX y análisis de los productos de reacción en cromatografía en capa delgada (ILC). Las especies radiactivas aisladas más bien correspondieron a ATP unido inespecíficamente al complejo glicógeno-proteína y no a una real actividad PPK. La P60 recombinante (P60r) mostró actividad GT. Sin embargo, no presentó actividad PPK en ausencia o presencia de glicógeno. Se concluyó que la P60 es una glicógeno sintasa, no siendo responsable de la actividad PPK presente en extractos crudos de S. acidocaldarius. Esta glicógeno sintasa resultó fosforilada in vivo. La presencia de poliP y la actividad PPK detectada en membranas de S. acidocaldarius sugerían que existe una proteína responsable de actividad PPK, por lo que se realizó una búsqueda mediante métodos bioinformáticos en el genoma disponible vía Internet de S. solfataricus, con resultados negativos. Para continuar con la identificación de los genes involucrados en el metabolismo de poliP en Sulfolobus se caracterizó un fragmento del gen ppрх presente en el genoma de S. solfataricus. Este fragmento correspondió a un gen ppx con similitud al gen ppx de E. coli. La PPX recombinante de S. solfataricus resultó funcional. Se midió la actividad PPX durante el crecimiento en S. solfataricus siendo menor hacia la fase estacionaria que en la fase exponencial, de acuerdo con los niveles de poliP en estos estadíos. En conclusión, el aumento de los niveles de poliP ante condiciones de carencia de nutrientes en S. solfataricus, la actividad PPK detectada y la existencia de un gen ppx funcional sugieren que los poliP están sujetos a una regulación que depende de componentes genéticos y que responde a factores del ambiente.

The domain Archaea is the third domain of life and it comprises extremophile microorganisms. Among them, the thermoacidophiles Sulfolobus acidocaldarius, S. solfataricus and S. metallicus grow at pH 1.5-3.0 and 70-80°C. At present, there is a great interest to know how these microorganisms manage to survive in their environments. In response to nutrient limitation and during stationary phase, bacteria dynamically accumulate inorganic polyphosphates (polyP). The only pathway for the synthesis of polyP that has been established in Bacteria is the polymerization of the terminal phosphate of ATP through the action of the enzyme polyphosphate kinase (PPK). Also, the enzyme exopolyphosphatase (PPX) is responsible for the hydrolysis of polyP to render Pi. There are strong evidences that polyP has a role in the physiological adjustments of Escherichia coi to environmental changes and during the stationary phase of growth. We have analyzed the global response of S. acidocaldarius to heat shock and phosphate starvation. During these experiments we observed the presence of electron dense bodies, that are typically described as polyP. This observation and the reported purification of a glycogen-bound protein of 60 kDa (P60) with PPK and glycosil transferase (GT) activities from S. acidocaldarius suggested the presence of polyP in this microorganism. Therefore, our objective was to characterize the genetic components of the metabolism of polyP in Sulfolobus genera and their relation to the stress response. During this thesis, we detected polyP in S. acidocaldarius and S. solfataricus using a quantitative enzymatic method. The gene for the alleged PPK and a ppx gene from the genome of S. solfataricus were characterized. We found that polyP levels increase in the stationary phase of growth and in response to certain nutritional deficiencies as amino acid starvation. The previously reported PPK (P60) turned out to be highly similar to glycogen synthases from Archaea and Bacteria and also showed GT activity. However the protein did not show similarity with the known PPKs and the PPK activity was very low. With the objective to characterize the supposed synthesized polyP, the 32P-labeled material was extracted by CsCl gradient and analyzed by treatment with PPX and thin layer chromatography (TLC). We found that the isolated labeled material corresponded most probably to a nonspecifically ATP bound to the glycogenprotein complex and not to a real PPK activity. The recombinant P60 (P60r) did not show PPK activity even in the presence of glycogen, showing GT activity instead. We concluded that P60 is a glycogen synthase that is not responsible for the PPK activity detected in crude extracts from S. acidocaldarius. This glycogen synthase was phosphorylated in vivo. The presence of polyP and the PPK activity detected in membrane fractions from S. acidocaldarius suggested the existence of a PPK-like protein. Therefore, by using bioinformatic tools, we searched for this protein in the available genome sequence of S. solfataricus. However, we could not find an homologous ppk gene. To further identify genes involved in polyP metabolism in Sulfolobus, we characterized a ppx gene fragment from the genome of S. soflfataricus. This fragment corresponded to an entire ppx gene similar to the ppx gene from E. coli. The recombinant PPX from S. solfataricus was functional in E. coli. The PPX activity of crude extracts from S. solfataricus was higher during the exponential phase of growth than during the stationary phase in accordance with the observed levels of polyP. In conclusion, the increase of polyP levels in response to nutrient limitations, the detected PPK activity and the existence of a ppx gene in S. solfataricus suggest that polyP metabolism is regulated by genetic components that are responsive to the environment.