Bioprospecting for actinomycetes producing antimicrobial compounds isolated from marine sediments by characterizing genetic clusters involved in the biosynthesis of secondary metabolites

Abstract

Bioactive compounds are increasingly required for diverse biotechnological applications. Among them, the development of new drugs is one of the major relevances due to the steady rise in the number of antibiotic-resistant bacterial pathogens. The phylum Actinobacteria, represent the most prominent group of microorganisms for the production of bioactive compounds, notably antibiotics, antifungal and antitumor agents. Many bioactive natural products with applied potential have been isolated from actinomycetes derived from sea sediments. Therefore, an excellent alternative to discover the potential of novel natural products is provided by the marine environment. Marine ecosystems are particularly suited for bioprospecting, a process that aims to identify and isolate natural compounds with the aid of its genetic material. In this line, the marine coasts of Chile remain poorly explored and contain a high diversity of microorganisms, many of which must still to be described. The bioprospection of new actinomycetes isolates from poorly explored marine environments can lead to the discovery of novel bioactive compounds with biotechnological potential. In this context, the exploration of the cultivable diversity of actinomycetes in marine sediments from a remote fjord of Chile, the Comau fjord located in Northern Chilean Patagonia, was proposed. Twenty five actinomycetes comprising 10 genera were isolated and characterized, for their tolerance to abiotic stress, marine adaptations, susceptibility to commercial antibiotics, biochemical assays and phylogenetic relationships. Five actinomycetes are proposed to be novel species. Moreover, antimicrobial activity among the actinomycetes was assessed, showing a promising potential to produce bioactive compounds. A great number of bioactive molecules belong to the group of polyketides, nonribosomal peptides or a combination of both. These metabolites are a vast group of structurally diverse natural compounds produced by a variety of microorganisms. The polyketide synthases (PKS) and nonribosomal peptide synthetases (NRPS) biosynthetic systems are organized in genetic clusters, and thus, their bioinformatic detection through whole genome sequencing is possible. Therefore in this study, five actinomycetes presenting antimicrobial properties and genes encoding for PKS/NRPS were selected for their subsequent whole genome sequencing in order to study these metabolic routes involved in the synthesis of bioactive compounds. In particular, one strain, Streptomyces sp. H-KF8, presented 26 biosynthetic gene clusters (BGCs), where two of them corresponded to NRPS routes. These metabolic pathways were genetically characterized, and prediction of the chemical structure of their products was proposed. Notably, a large number of these clusters have no similarities with other known clusters, suggesting that Streptomyces sp. H-KF8 possess novel metabolic routes involved in the synthesis of novel compounds. Finally, a conventional approach for the extraction of the compound(s) using organic solvents and subsequent bio-guided fractionation of the crude extract of Streptomyces sp. H-KF8 was performed, to gain insights into the biological activity and chemical nature of the antimicrobial molecules that are being produced by this bacterium. Mass spectrometry techniques such as ESI FT ICR MS, MALDI-TOF MS and Imaging MS, were used to detect molecules that are being expressed under antagonistic interactions, and to provide the monomer composition of the selected masses. These candidates molecules were subsequently compared to the bioinformatic data of the sequenced genome of Streptomyces sp. H-KF8, to unveil the link between the genomic-metabolic relationship. Specifically, a connection between the NRPS cluster#6 and the metabolites produced by Streptomyces sp. H-KF8 was accomplished. Proposed mechanism of action of this antimicrobial metabolite along with tailouring reactions that may modify the peptidic core are also described. Altogether, these results suggest that Chilean Patagonian fjords are suitable environments for bioprospecting for novel species of actinomycetes with promising antimicrobial activity. Genome sequencing was a fundamental tool to stablish the genetic potential to produce bioactive compounds. Streptomyces sp. H-KF8 demonstrated to harbour novel biosynthetic gene clusters for the synthesis of secondary metabolites, where one of them, the cluster #6, showed a sustained correlation among the predicted bioinformatic and the experimental data, suggesting the production of a novel antimicrobial compound of a glycopeptide nature.

Los compuestos bioactivos son ampliamente requeridos para diversas aplicaciones biotecnológicas. Entre ellas, el desarrollo de nuevas drogas es de mayor relevancia debido al dramático aumento de bacterias patógenas resistentes a antibióticos. El phylum Actinobacterias representan el grupo de microorganismos más prominente en relación a la producción de compuestos bioactivos, como antibióticos, antifúngicos y antitumorales, entre otros. Numerosos productos naturales bioactivos con potencial aplicable han sido aislados de actinomycetes derivadas de sedimentos marinos. Por esta razón, una excelente alternativa para descubrir nuevos productos naturales puede proveer del ambiente marino. Los ecosistemas marinos son particularmente apropiados para la bioprospección, un proceso que tiene como objetivo identificar y aislar compuestos naturales a partir de su material genético. En esta línea, las costas de Chile aún permanecen inexploradas y contienen una alta diversidad de microorganismos, muchos de los cuales todavía no han sido descritos. La bioprospección de nuevos aislados de actinomycetes obtenidos de ambientes marinos inexplorados, podría llevar al descubrimiento de compuestos bioactivos novedosos con gran potencial biotecnológico. En este contexto, la exploración de la diversidad cultivable de actinomycetes desde sedimentos marinos del remoto fiordo de Comau, ubicado en la Patagonia Norte de Chile, fue propuesto. Veinticinco actinomycetes que comprenden 10 géneros fueron aislados y caracterizados por su tolerancia a estrés abiótico, adaptaciones marinas, susceptibilidad a antibióticos comerciales, ensayos bioquímicos y relaciones filogenéticas. De éstos, cinco aislados son propuestos como nuevas especies. Adicionalmente, la actividad antimicrobiana entre todos los aislados fue evaluada, mostrando un prometedor potencial para producir compuestos bioactivos. Un gran número de moléculas bioactivas pertenecen al grupo de los policétidos, péptidos no-ribosomales o a la combinación de ambos. Estas moléculas son un vasto grupo de compuestos naturales con diversas estructuras producidos por una gran variedad de microorganismos. Las policétido sintasas (PKS) y las sintetasas de péptidos no-ribosomales (NRPS) son sistemas biosintéticos que están organizados en agrupamientos genéticos, por lo tanto, su detección bioinformática a través de la secuenciación de genomas completos es posible. En este estudio, cinco actinomycetes que presentaron propiedades antimicrobianas y genes que codificaban para PKS/NRPS, fueron seleccionadas para la subsecuente secuenciación de sus genomas completos con el fin de estudiar sus rutas metabólicas involucradas en la síntesis de compuestos bioactivos. En particular, la cepa Streptomyces sp. H-KF8 presentó 26 agrupamientos biosintéticos (BGCS), donde dos de ellos correspondieron a rutas de NRPS. Estas vías metabólicas fueron caracterizadas genéticamente, y la predicción de la estructura química de sus productos fue propuesta. Notablemente, un gran número de estos BGCs no tuvieron similitud con otros BGCs conocidos, lo cual sugiere que Streptomyces sp. H-KF8 posee nuevas rutas metabólicas involucradas en la síntesis de nuevos compuestos. Finalmente, una aproximación convencional para la extracción del (o los) compuesto(s) usando solventes orgánicos y un subsecuente fraccionamiento del extracto crudo de Streptomyces sp. H-KF8, fue llevado a cabo para ganar conocimiento acerca de la actividad biológica y la naturaleza química de las moléculas antimicrobianas producidas por esta cера. Técnicas de espectrometría de masas tales como ESI FT ICR MS, MALDI-TOF MS e Imaging MS, fueron usadas para detectar moléculas presentes bajo interacciones antagónicas, y para proporcionar información sobre la composición de los monómeros de masas seleccionadas. Las moléculas candidatas fueron comparadas contra los datos bioinformáticos del genoma secuenciado de Streptomyces sp. H-KF8 para revelar la relación genómica-metabolómica. Específicamente, una conexión entre el agrupamiento NRPS #6 y los metabolitos producidos por Streptomyces sp. H-KF8 fue lograda. Además, un mecanismo de acción propuesto para el metabolito antimicrobiano, en conjunto con las reacciones de modificación post-ensamblaje las cuales modifican el esqueleto peptídico, también son descritas. En conjunto, estos resultados sugieren que los fiordos de la Patagonia Chilena son ambientes apropiados para la bioprospección de nuevas especies de actinomycetes con actividad antimicrobiana prometedora. La secuenciación del genoma fue una herramienta fundamental para establecer el potencial genético para la producción de compuestos bioactivos. Streptomyces sp. H-KF8 demostró poseer nuevos BGCs para la síntesis de metabolitos secundarios donde uno de ellos, el agrupamiento NRPS #6, mostró tener una sostenida correlación entre la predicción bioinformática y los datos experimentales, sugiriendo la producción de un nuevo compuesto antimicrobiano de naturaleza glicopeptídica.