Ensamblaje, despegamiento y cambios conformacionales de la proteína FtsZ de Escherichia coli

Abstract

La proteína FtsZ tiene un rol clave en la citoquinesis bacteriana donde sepolimeriza formando el anillo Z.In vitro, la proteína FtsZ se auto-ensambla en presencia de GDP formando polímeros curvos mientras que en presencia de GTP polimeriza formando polímeros rectos.El modelo que parece explicar mejor a la polimerización de FtsZ es el modelo cooperativo con una concentración crítica, donde el primer paso consiste en la formación del núcleo dimérico a través de un cambio conformacional que permite la elongación del polímero recto. Posteriormente, la hidrólisis del nucleótido conduce a la despolimerización a través de una transición entre los estados recto y curvo de FtsZ que debilita la interacción de las subunidades en el polímero.El trabajo desarrollado en esta Tesis abordó desde un punto de vista experimental la hipótesis de que FtsZ se auto-ensambla en presencia de GDP y GTP y que ocurren cambios conformacionales en la estructura por el intercambio entre los nucleótidos. La influencia del auto-ensamblaje sobre la estructura de FtsZ se estudió con una caracterización termodinámica de la oligomerización y del desplegamiento. E ensamblaje se estudió con cromatografía de exclusión molecular y espectroscopía de fluorescencia y el desplegamiento se estudió con dicroísmo circular y espectroscopla de correlación de fluorescencia. El análisis cromatográfico demostró la presencia de monómeros, dímeros y tetrámeros cuyas poblaciones dependen de la concentración total de proteína. Los experimentos de dilución de conjugados fluorescentes de FtsZ revelaron que las constantes de disociación de los dímeros y tetrámeros son del orden de 106. Las mediciones de fluorescencia resuelta en el tiempo apcyaron la presencia de tetrámeros a altas concentraciones de proteína y la presencia de monómeros a bajas concentraciones de proteína. El estudio de desplegamiento demostró que el desplegamiento de tres estados de FtsZ se debe a la presencia del dímero en la solución y que el monómero posee un mecanismo de desplegamiento de dos estados.El equilibrio de disociación de los dímeros en monómeros indica que hay una fracción significativa de dímeros en la concentración crítica de polimerización lo que apoya el modelo del dímero como especie nucleadora de la polimerización de FtsZ. Para estudiar a los cambios conformacionales inducidos por el intercambio de los nucleótidos GDP y GTP en FtsZ, es decir formando polímeros curvos y rectos, respectivamente, en esta Tesis se usó la fluorescencia intrínseca del triptófano introducido por mutagénesis sitio-dirigida. Los residuos de triptófano se encuentran en tres regiones relevantes de la estructura de FtsZ, F40W en el dominio N, F275W en el dominio C y Y222W en la interfase entre los dominios N y C. Sobre la base de estudios de dinámica molecular, y también de estudios de apagamiento de la fluorescencia, se encontró que los tres residuos de triptófano se encuentran ocultos del solvente.Se midió a las constantes de disociación de los nucleótidos a las proteínas y se encontró que las mutaciones no afectaron la afinidad por lus mismos. Usando fluorescencia resuelta en el tiempo se midieron los tiempos de vida de los triptófanos, cuya fluorescencia es sensible al ambiente local, y se encontró que los mayores cambios estructurales ocurren entre los dominios N y C, en la interfase interdominio, donde un movimiento tipo bisagra entre los dominios sería el cambio conformacional responsable de la transición desde los polímeros rectos a los polímeros curvos.

FtsZ is a major protein in bacterial cytokinesis that polymerizes to form the Zring. In vitro, FtsZ self-assembles in the presence of GDP nucleotide to form curved polymers while in the presence of GTP it polymerizes to form straight filaments. The best model that explains FtsZ polymerization is a cooperative mechanism with a critical concentration where the first step is the formation of a dimer nucleus through a conformational change allowing straight polymer elongation. Subsequently, nucleotide hydrolysis drives depolymerization through a transition between straight and curved states of FtsZ that weakens subunit interactions in the polymer. Work developed in this dissertation assessed experimentally the hypothesis that FtsZ self-assembles in the presence of GDP and GTP and that a conformational change occurs in FtsZ structure when the nucleotides exchange at the active site. The influence of the self-assembly on FtsZ structure was studied with a characterization of its oligomerization and unfolding thermodynamics. The assembly was studied using size-exclusionchromatography and fluorescence spectroscopy, and the unfolding was studied úsing circular dichroism and two-photon. fluorescence correlation spectroscopy. The chromatographic analysis demonstrated the presence of monomers, dimers, and tetramerswith populations dependent on protein concentration. Dilution experiments using fluorescent conjugates revealed dimer-to-monomerand tetramer-to-dimer dissociation constants in the micromolar range. Time resolved fluorescence measurements of FtsZ conjugates supported the presence of tetramers at high protein concentrations and monomersat low protein concentrations. The unfolding study demonstrated that the three-state unfolding of FtsZ was due to the mainlydimeric state of the protein, and that the monomer unfolds through a two-state mechanism. The monomer-to-dimer equilibriumcharacterized here indicates a significant fraction of stable dimers at the critical concentration for polymerization,supporting a role of the dimeric species in the first steps of FtsZ polymerization. To study the conformational changes induced by exchange between GDP and GTP nucleotides, i.e., in the presence of straight and curved polymers, respectively, in this work the intrinsic fluorescence of site-directed tryptophan mutants was used. The tryptophan residues were located in three relevant regions along FtsZ structure, F40W at the N-domain, F275W at the C-domain and Y222W at the interdomain interface. Based on molecular dynamics simulations, and in intrinsic fluorescence collisional quenching experiments, the tryptophan located at the three sites in FtsZ structure were found to be buried form solvent accessibility. Measurement of nucleotide dissociation constants indicated that the mutations did not affect the nucleotide affinity: Tryptophan lifetimes were measured using time-resolved fluorescence. knowing that the excited state is sensitive to changes in local environment, and changes at the interdomaininterface were detected upon nucleotide exchange. These conformational changes were related to a hinge-like movement between domains that might responsible for the transition between straight and curved polymers.