Estudios fenotípicos de la virulencia de Pseudemonas aeruginosas PAO1 utilizando como modelo de infección la ameba Dictyostelium discoideum

Abstract

El aumento y la propagación de bacterias patógenas resistentes a múltiples antibióticos es un motivo de alarma mundial y ha evolucionado los mecanismos bacterianos de resistencia a los antibióticos. En la actualidad, la mayoría de los antimicrobianos existentes en el mercado o en desarrollo clínico sólo se centran en un pequeño número de procesos bacterianos esenciales, tales como la síntesis de proteínas, las rutas metabólicas centrales y la función de la membrana y pared celular. Debido al aumento de la resistencia a los antibióticos que actúan sobre estos pocos objetivos, hay una urgente necesidad de buscar nuevas estrategias celulares para combatir las infecciones bacterianas. La estrategia de afectar la virulencia bacteriana (anti-virulencia) sin afectar la viabilidad celular ha sido una estrategia novedosa. Sin embargo, se necesitan nuevos blancos moleculares que puedan cumplir con estos objetivos. Pseudomonas aeruginosa, es un patógeno oportunista capaz de colonizar un amplio rango de ambientes, y el causante de una serie de infecciones agudas o crónicas en los humanos. Una de sus principales características es que posee un arsenal de factores de virulencia, entre los que destacan los pigmentos tóxicos como sideróforos y el pigmento piocianina, agentes clave en el proceso infectivo. Además, P. aeruginosa presenta una resistencia intrínseca y adaptativa a numerosos antibióticos, lo que dificulta los tratamientos médicos y la convierten en un modelo de estudio para evaluar la resistencia microbiana a los antibióticos. Mutantes de P. aeruginosa deficientes en el metabolismo de los polifosfatos (poliP), específicamente en el gen ppk1, que sintetiza los poliP a partir de AТР, presentan defectos en distintos procesos celulares, como la motilidad, la comunicación celular, la formación de biopelículas, y la virulencia. Además, resultados obtenidos previamente en nuestro laboratorio indican que el mutante ppk1- en P. aeruginosa PAO1 es sensible a múltiples antibióticos y a distintos tipos de estrés, además de ser atenuado en su virulencia en hospederos anternativos como el pez cebra (Danio rerio) y el nemátodo Caenorhabditis elegans. Teniendo en cuenta que la enzima PPK1 no es una proteína esencial para la célula pero está involucrada en la virulencia y la persistencia en P. aeruginosa y en numerosos patógenos; la síntesis de los poliP y particularmente la PPК1 constituye un blanco molecular promisorio para la búsqueda y el diseño de nuevos antimicrobianos de amplio espectro que no apunten a erradicar al patógeno, sino a reducir su virulencia y persistencia. En este trabajo, desarrollamos una nueva metodología para evaluar a gran escala la virulencia de P. aeruginosa mediante el estudio del desarrollo social de la ameba D. discoideum. Nuestro método nos permitió evaluar la virulencia de mutantes de la síntesis de los poliP y de la síntesis de los sideróforos y pigmentos tóxicos como pioquelina, pioverdina y piocianina. Finalmente, y con un enfoque en el desarrollo de moléculas anti-virulencia dirigidas contra la enzima PPK1 de P. aeruginosa PAO1, utilizamos a D. discoideum como modelo hospedero-patógeno. Nuestro enfoque considera la selección de moléculas que 1) no maten a la bacteria patógena (P. aeruginosa), 2) no afecten al hospedero (D. discoideum) ni a las bacterias beneficiosas (K.aerogenes) y 3) interrumpan la producción de factores de virulencia que dañan al anfitrión. En este trabajo, se demuestra que la ameba social D. discoideum es un modelo efectivo y sencillo para evaluar la virulencia de la bacteria patógena P. aeruginosa PAO1. Esto permitió la búsqueda de nuevas moléculas que disminuyeron la virulencia bacteriana in vivo en este modelo alternativo, y que luego pueden ser corroboradas en modelos de mamíferos.

The increase and spread of multi-drug-resistant (MDR) pathogens, which have evolved resistance mechanisms against specific antibiotics, is a cause for alarm. Today, the majority of existing antimicrobials on the market or in clinical development only focus on a small number of essential bacterial processes such as protein synthesis, central metabolic pathways and cell membranes function. With an increasing rate of resistance to different drugs that act upon those few targets, there is an urgent need to search for novel targets. The selection of the correct cellular or molecular target with non-vital functions but related with the production of virulence factors is very important. P. aeruginosa is an opportunistic pathogen, able to colonize a wide range of environments, and it is the cause of a number of acute or chronic infections in human. One of its main features is the number of virulence factors, such as toxic pigments such as siderophores, and pyocyanin pigment, all of then key players in the infective process. In addition, P. aeruginosa has an intrinsic resistance to many antibiotics, making medical treatments difficult. It has been reported that ppk1 mutants of P. aeruginosa are deficient in the synthesis of polyP and display several cellular defects including motility, cell communication, biofilm formation and virulence. Furthermore, phenotypic microarrays results (Biolog Inc.) previously obtained in our laboratory indicates that ppk1-mutant- from P. aeruginosa PAO1 is sensitive to multiple antibiotics and different types of stress. The social amoeba Dictyostelium discoideum feeds on bacteria by phagocytosis and its growth and development is affected when facing pathogenic microorganism. Previously, a host model system based on D. discoideum was successfully used to identify P. aeruginosa virulence genes. In addition, P. aeruginosa has been shown to use similar virulence factors when infecting mammalian hosts or Dictyostelium amoebae. Interestingly, D. discoideum is among the few eukaryotes that possess orthologs of bacterial PPK1 (DdPPK1) and mutants of DdPPK1 are deficient in development, predation and sporulation. Particularly, in P. aeruginosa lawn, D. discoideum is killed leaving an intact bacterial lawn. However, on a lawn of Pappk1 mutant, the social amoeba is proved to be an effective predator as observed by the phagocytic plaques formed. As PPK1 enzyme is involved in cell metabolism rather than in essential functions, it is present in the three domains of life and there is a high degree of identity between PPk1 of different pathogens; the synthesis of polyP and particularly PPK1 is a promising target for the search and the design of new broadspectrum antimicrobials that do not kill the pathogen, but to reduce its virulence and persistence. In this work, we establish a novel developmental assay in the social amoeba D. discoideum to assess P. aeruginosa virulence. We evaluated different mutant strains of Pseudomonas aeruginosa PAO1, deficient in polyP metabolism, and synthesis of siderophore and toxic pigments such as pyochelin, pyoverdine, and pyocyanin. With a focus in developing antivirulence molecules targeting inorganic polyP synthesis in P. aeruginosa PAO1 we used D. discoideum as a host-pathogen model. Our approach considers the screening of molecules that 1) do not kill the bacterial pathogen, 2) avoid affecting the host and its beneficial bacteria and 3) disrupt the production of virulence factors that damage the host. Here we demonstrate that D. discoideum offered a robustness and easy manipulation for an efficient host-pathogen model for the screening of antivirulence molecules. Moreover, the amoeba anti-virulence assays in combination with developmental secondary effects tests allowed us further characterization by selecting those compounds with anti-virulence properties without cytotoxic or antibiotic effects. In summary, we described a simple high-throughput assay using D. discoideum and report the first in vivo anti-virulence agents targeting P. aeruginosa PPK1 without side effects to the host or its beneficial bacteria.