Estudio de los determinantes de resistencia al cobre en la arquea termoacidófila sulfolobus metallicus

Abstract

Sulfolobus metallicus es un arqueón termoacidófilo capaz de oxidar fierro y azufre, ampliamente utilizado en la extracción de cobre desde minerales como la calcopirita, durante el proceso de biolixiviación. El uso exitoso de este microorganismo se debe en gran medida a su capacidad de prosperar en ambientes con altas concentraciones de metales pesados y a altas temperaturas de crecimiento, que aceleran los procesos de bioloxiviación. El cobre es un importante cofactor para varias enzimas involucradas en diversos procesos celulares. Mientras que cantidades trazas de este metal son esenciales para la vida, su exceso puede catalizar la formación de especies reactivas de oxígeno causando importantes daños celulares. Es así como procariontes y eucariontes han desarrollado diversos mecanismos de resistencia con el fin de evitar los efectos nocivos del cobre. Recientemente demostramos que S. metallicus es capaz de crecer en la presencia de hasta 200 mM de CuSO4 (Remonsellez y cols., 2006). Este nivel de resistencia al cobre presentado por S. metallicus es uno de los más altos reportados a la fecha, y supera en 40 veces la resistencia que muestran otras especies del género Sulfolobus y de bacterias como Escherichia coli y Enterococcus hirae. Hasta ahora no existen estudios sobre los mecanismos genéticos y bioquímicos que le permiten a S. metallicus prosperar en tan altas concentraciones de cobre. La comprensión de estos mecanismos podría ser de mucha utilidad en potenciales mejoras genéticas de los microorganismos biolixiviantes para aumentar la eficiencia de los procesos de biolixiviación. Aunque la resistencia al cobre ha sido ampliamente estudiada en bacterias, se tiene escasa información sobre los mecanismos de resistencia a este metal en arqueas. Recientemente se ha identificado un grupo de genes (cop) de resistencia al cobre altamente conservado en algunas especies del dominio Archaea. Éste incluye un transportador de tipo ATPasa posiblemente involucrada en la exportación del metal (cop.A), una metalochaperona de cobre (copM) y un regulador transcripcional (cop1) que controlaría la expresión de los genes cop. Debido a que aún no se dispone de la secuencia genómica de S. metallicus, utilizamos las estrategias de CODEHOP-PCR y "genome walking" para buscar y aislar los genes cop en este microorganismo. Aquí, reportamos la presencia en el genoma de S. metallicus de 2 loci cop (cop1 y cop2), con la estructura cорT1, copM1, сорА1 у соpT2, cоpM2, cop.42, respectivamente. Esta duplicación génica constituiría una característica inédita para un representante del dominio Archaea y podría explicar en parte la elevada resistencia al cobre que muestra S. metallicus. Mediante análisis transcripcionales determinamos que los pares génicos copMA1 у copMA2 se cotranscriben y los niveles de los mRNA policistrónicos aumentan concomitantemente por la adición externa de Cu²* o cuando se generá este ión metálico producto de la oxidación de la calcopirita por el microorganismo. La expresión de estas ATPasas (CopA1 y CopA2) en la presencia de cobre sugiere que el sistema de transporte está funcionando para permitir la salida del metal. Adicionalmente, reportamos en S. metallicus que mientras el gen copT2 mostró una expresión constitutiva, los niveles del transcrito copT1 aumentaron en la presencia de Cu²*. Con el objetivo de encontrar otros posibles mecanismos responsables de la resistencia al cobre en S. metallicus analizamos la expresión diferencial de proteínas de membrana en células expuestas a Cut2. Así, se encontraron aumentadas proteínas involucradas en el estrés oxidativo y en el plegamiento y la degradación de las proteínas. Estos resultados sugieren que la presencia de cobre produce daño oxidativo, que afectaría la integridad de las proteínas, evidenciando que esta arquea usa múltiples mecanismos para resistir las altas concentraciones de cobre. Otro posible mecanismo adicional de resistencia al cobre en especies del género Sulfolobus comprendería a los polifosfatos (poliP). En nuestro grupo hemos demostramos que S. metallicus acumula altas cantidades de este polímero, y que cuando esta arquea se expone a cobre, los poliP se degradan progresivamente, lo que es acompañado por el exporte de iones fosfato, y supuestamente de los cationes de cobre, desintoxicando de esta forma el ambiente intracelular (Remonsellez y col., 2006). Para evaluar la contribución del metabolismo de los poliP en la resistencia al cobre en los Sulfolobales, y debido a que no se dispone de herramientas para la manipulación genética en S. metallicus, generamos una cepа recombinante de S. solfataricus incapaz de acumular poliP. Así, determinamos que esta cера recombinante, carente de poliP, mostró una mayor sensibilidad al cobre demostrándose experimentalmente la participación de los poliP en la resistencia al metal. Adicionalmente, mediante un estudio preliminar sobre los cambios en el proteoma de la cepa de S. solfataricus carente de poliP, encontramos aumentadas proteínas relacionadas al ciclo de Krebs y al estrés oxidativo. Estos hallazgos sugieren la relevancia tanto en las funciones energéticas como regulatorias de los poliP en la cepa recombinante de S. solfataricus carente de poliP, lo que podrían explicar su mayor sensibilidad al cobre. Los resultados obtenidos en este estudio nos permiten concluir en conjunto que los elementos claves en la resistencia al cobre en S. metallicus parecen ser la duplicación de genes cop de resistencia al cobre, un mecanismo basado en la acumulación de poliP y una respuesta defensiva ante el estrés oxidativo.

Sulfolobus metallicus is a thermoacidophile archaea capable of oxidizing iron and sulfur. It is widely used in the extraction of copper from minerals such as chalcopyrite in the process of bioleaching. This microorganism is succesfully used in bioleaching processeses mainly due to its capacity to survive in environments with high heavy metal concentrations and to grow at high temperatures, where the bioleaching processes are favored. Copper is an important cofactor for several enzymes involved in diverse cellular processes. While trace amounts of copper are essential for life, an excess of this metal can catalyze the formation of reactive oxygen species triggering significant cellular damage. In order to avoid the harmful effects of copper prokaryotes and eukaryotes have developed numerous mechanisms involved in the resistance this metal. Our laboratory recently demonstrated that S. metallicus is able to grow in the presence of up to 200 mM CuSO, (Remonsellez et al., 2006). The level of copper resistance presented by S. metallicus accounts as one of the highest reported to date, exceeding in over 40 times the resistance found in other species of the genus Sulfolobus and of bacteria, including Escherichia coli and Enterococcus hirae. Thus far, there are no studies on the prospective genetic and biochemical mechanisms that enable S. metallicus to thrive in such high concentrations of copper. Understanding these mechanisms could be particularly useful in potential genetic improvement of the bioleaching microorganisms, which could likely increase the efficiency of bioleaching processes in due course. Although resistance to copper has been widely studied in bacteria, the reported information on mechanisms of resistance to this metal in archaea is very scarce. Recently a highly conserved group of genes (op) related to the resistance to copper was identified in some species of Archaea. Considering that the genomic sequence of S. metallicus is not yet available we made use of strategies such as CODEHOP-PCR and "genome walking" order to look and isolate for the cop genes in this microorganism. in Interestingly, we found two cop loci (cop1 and cop2) within the genome of S. metallicus, having the genomic structure copT1, cорM1, сор.A1 and copT2, coрM2, cор.A2, respectively. This finding would constitute an unprecedented feature for a representative of the Archaeа domain. Such a genetic duplication could somewhat explain the high resistance to copper detected in S. metallicus. Moreover, we determined that the genetic pair copMA1 and copMA2 are cotranscribed. In fact, the levels of detected policystronic mRNA concomitantly increased in the presence of Cu²+ or when the organism uses chalcopyrite as an energy source. The expression of these ATPases (CopA1 and CopA2) in the presence of copper suggests that the transport system is in effect working, enabling a steady output of copper. In addition, it we reported that copT1 transcript levels were increased in the presence of Cut, even while copT2 showed a constitutive expression. To find additional mechanisms potentially involved in the high resistance to copper in S. metallicus, we analyzed the differential expression of membrane proteins in cells exposed to Cu*2. Several proteins which have been identified to be involved in cellular processes including oxidative stress and folding and degradation of proteins were found with increased expression. These results illustrate the fact that the presence of copper produces oxidative damage,which would in turn affect protein integrity, suggesting that this archaea makes use of multiple mechanisms in order to resist high copper concentrations. Another potential mechanism involved in copper resistance in species of the genus Sulfolobus would involve polyphosphates (polyP). We have already demonstrated that S. metallicus accumulates high amounts of this polymer. Furthermore, when exposed to copper, polyP is progressively degraded, a process which is linked to the export of phosphate ions, presumably together with copper cations, thus detoxifying the intracellular environment (Remonsellez et al., 2006). Since there are no tools for genetic manipulation in S. metallicus, to assess the contribution of polyP metabolism in copper resistance in Sulfolobales, we generated a recombinant strain of S. solfataricus which is incapable of accumulating polyP. This polyP deficient recombinant strain showed an augmented copper sensitivity, being and experimental demonstration of the involvement of polyP in copper resistance. to Additionally, through a preliminary study on the changes in the proteome of the S. solfataricus polyP deficient strain, we found an increased expression of proteins related both the Krebs cycle and oxidative stress mechanism, which suggesting a link between the higher copper sensitivity of the S. solfataricus recombinant strain and the lack polyP. Altogether, the results obtained in this study allow us to conclude that the key elements in the resistance to copper in S. metallicus appear to be the duplication of the copper resistance op genes, a polyP-based accumulation mechanism and a defensive response to oxidative stress.