Rol de los mecanismos de resistencia a mercurio en la resistencia cruzada a telurito en bacterias psicrotolerantes aisladas del territorio Antártico Chileno

Abstract

A bajas concentraciones, algunos metales pesados y metaloides pueden ser sumamente tóxicos para los microorganismos. Entre ellos, mercurio (II) y telurito, poseen las concentraciones inhibitorias mínimas (MIC) más bajas para E. coli. Ambos ejercen daño celular por depleción de tioles, inactivación de enzimas y estrés oxidativo. La resistencia a mercurio está dada por el operón mer, en que finalmente la flavoenzima MerA reduce mercurio (II) a mercurio elemental (volátil y menos tóxico). Por otro lado, aun cuando a la fecha no se han descrito mecanismos específicos de destoxificación de telurito, algunos metabolitos y enzimas propias del metabolismo -así como otras que participan en respuesta celular al estrés oxidativo- pueden reducir telurito a su forma menos tóxica, teluro elemental. A su vez, la Antártica se caracteriza por estar expuesta a diversos tipos de estrés abiótico, como por ejemplo bajas temperaturas, alta salinidad, radiación UV, entre otros, los que en general causan estrés oxidativo. Últimamente se ha evidenciado un aumento drástico de contaminación por metales pesados en ese continente debido al fenómeno conocido como destilación global. Por este motivo, el continente antártico se ha convertido en un lugar de muestreo interesante para aislar cepas bacterianas resistentes a múltiples tipos de estrés y entre ellos, a aquel debido a la presencia de metales pesados. El estudio de mecanismos moleculares de resistencia de bacterias psicrotolerantes a metales pesados y metaloides tan tóxicos como mercurio y telurito podría permitir el diseño de nuevas estrategias de biorremediación de sitios contaminados en ambientes de baja temperatura. En este contexto, se aisló bacterias desde la Antárticà que son resistentes a mercurio y telurito. La resistencia de estas bacterias al oxianión de teluro sólo se observa en presencia de mercurio, sugiriendo que éste gatillaría una respuesta de resistencia cruzadaa ambos tóxicos. El estudio de la resistencia cruzada a mercurio y telurito en bacterias antárticas psicrotolerantes se llevó a cabo utilizando cuatro aislados bacterianos (ATH-5, ATH-41, ATH-43 y ATH-62). Tres de ellos se relacionaron con el género Pseudomonas y uno con Psychrobacter. El operón mer se detectó sólo en las cepas de Pseudomonas. Para entender el fenómeno de resistencia cruzada se sometió a las bacterias a 4 tratamientos experimentales diferentes: control sin tóxicos, con mercurio, telurito o mercurio/telurito. Tanto curvas de crecimiento, MICs como halos de inhibición en medio sólido mostraron que todos los aislados son resistentes a mercurio y telurito. Sin embargo, el fenotipo de resistencia cruzada sólo se observó en las Pseudomonas, el que fue particularmente notorio en ATH-43. El análisis de parámetros moleculares de toxicidad mostró que individualmente tanto mercurio como telurito producen estrés oxidativo en las cepas ATH. En presencia de ambos tóxicos, los niveles de especies reactivas de oxígeno (ROS) fueron más bajos que cuando sólo telurito estuvo presente, efecto que de nuevo fue más evidente en la сера ATH-43. Aun cuando el contenido de tioles totales (RSH) disminuyó en presencia de mercurio o telurito, sólo ATH-43 mostró una recuperación a niveles normales de RSH cuando se expuso simultáneamente a ambos metales. Mientras el telurito alteró la viabilidad de todas las cepas, ésta se recupera en presencia de mercurio. La secuenciación del genoma de ATH-43 reveló la presencia de genes de resistencia a múltiples metales y antibióticos, además de un gran número de genes relacionados con estrés oxidativo. Por otro lado, el un análisis transcriptómico de esta cepa mostró que la exposición a mercurio, telurito o mercurio/telurito resulta en la expresión diferencial de ~200 genes en comparación al control sin tratamiento. En las 3 condiciones se observó la inducción de genes relacionados con transporte, transcripción, traducción, estrés oxidativo, resistencia a metales y cadena transportadora de electrones, entre otros. Interesantemente, la expresión de estos genes fue significativamente menor con telurito que en presencia de mercurio o mercurio/telurito. Por su parte, los genes cuya expresión se reprimió en estas condiciones incluyen metabolismo de aminoácidos, carbohidratos, lípidos, ácidos nucleicos y transportadores, entre otros. También se determinó que MerA posee actividad telurito reductasa in vitro, actividad que no aumentó in vivo -como se esperaba- en cultivos expuestos a mercurio. Finalmente y en su conjunto, estos resultados sugieren que el fenómeno de potenciación de resistencia cruzada se debería más bien a mecanismos generales de estrés (por ejemplo, respuesta a estrés oxidativo) estimulados por la presencia de mercurio, que al sistema específico de destoxificación de mercurio (operón mer).

Low concentrations of some heavy metals and metalloids can be very toxic for most microorganisms. Among them, mercury (II) and tellurite, have the lowest minimal inhibitory concentrations in E. coli. Both of them exert cell damage by thiol depletion, enzyme inactivation and oxidative stress. Mercury bacterial resistance is given by mer operon which aims the transformation of toxic cationic mercury by the flavoenzyme MerA, to elemental mercury which is volatile and less toxic. On the other hand, the mechanisms of tellurite detoxification are not well understood. However, it has been demonstrated that some metabolic flavoenzymes are able to reduce tellurite to its lesstoxic form elemental tellurium, and also that an enhanced response against oxidative stress can confer tellurite resistance in some bacteria. The Antarctic continent is constantly exposed to diverse abiotic stresses like low temperature, high salinity, UV radiation, among others, which cause oxidative stress. Recently, it has been show a dramatic increase of heavy metals in Antarctica, mostly due the grasshopper effect. In this sense, the Antarctic continent has become an interesting place for sampling and isolation of bacterial strains resistant to multiple stresses, which include that produced by heavy metals. The understanding of molecular mechanisms of mercury and tellurite resistance, and also the oxidative damage associated to these psychrotolerant bacteria, could allow for the design of new bioremediation strategies of polluted sites of low temperature environments. In this context, we have isolated psychrotolerant bacteria from Antarctica that are resistant to mercury and tellurite. However, these strains are resistant to tellurite only in the presence of mercury, suggesting that Hg could somehow trigger a molecular response that confers cross-resistance to tellurite, as well as for mercury. The aim of this Thesis is to determine if tellurite resistance of psychrotolerant Antarctic bacteria exposed to mercury, is due an activation of molecular mechanisms against oxidative stress triggered by mercury, and tellurite reduction mediated by MerA enzyme. The cross-resistant phenotype to mercury and tellurite was carried out in four psychrotolerant Antarctic bacterial isolates (ATH-5, ATH-41, ATH-43 and ATH-62). Three ofthem belong to Pseudomonas genus and the other to Psychrobacter genus (ATH62). The mer operon was only detected in the Pseudomonas isolates. To understand this phenomenon all the strains were submitted to four experimental conditions: control, mercury, tellurite or mercury/tellurite treatments. Growth curves, MICs and growth inhibition zones experiments showed that all isolates were resistant to mercury and tellurite. However, cross-resistant phenotype was only observed in Pseudomonas strains, mainly in ATH-43. Molecular toxicity parameters showed that both toxics by itself produced oxidative stress in ATH strains. Interestingly, treatment with both toxics together decreased ROS levels in comparison with tellurite treatment, mostly in ATH-43. Regarding thiols content, mercury and tellurite presence considerably reduced the intracellular amount of thiols in all ATH strains. However, only in ATH-43 mercury/tellurite treatment produced and increment in thiols level as high as the control levels. On the other hand, tellurite affected cell viability in all ATH, but in the presence of mercury, viability was restored only in Pseudomonas strains. Sequencing of ATH-43 genome revealed the presence of multiple heavy metal and antibiotics resistance genes, and also a huge number of genes related with oxidative stress response. A transcriptomic profile analysis of ATH-43 showed that mercury, tellurite or mercury/tellurite treatments resulted in the differential expression of ~200 genes in comparison to control treatment. In the three conditions expressed genes were related to transport, transcription, translation, oxidative stress response, heavy metal resistance and electron chain transport. Interestingly, gene expression in tellurite treatment was significantly lower in magnitude when compared to mercury or mercury/tellurite exposure. When analyzing repressed genes in all treatments, most of them were related to aminoacid, carbohydrate, lipid, and nucleotides metabolism, among others. We also demonstrated that MerA exhibited tellurite reductase activity in vitro. However, this activity was not observed in vivo in crude extracts pre-treated with mercury. Altogether these results suggest that potentiation of the cross-resistant phenotype is principally due to activation of general stress response mechanisms (e.g. oxidative stress), and not due to the mer detoxification system.