Regulación de la expresión de los genes de la maduración del sistema productor de microcina E492

Abstract

La microcina E492 es una bacteriocina de baja masa molecular producida por Klebsiella pneumoniae RYC492. La producción de bacteriocinas es un fenómeno que es determinante en el equilibrio de las poblaciones de microorganismos. Para el caso de la producción de microcina E492 activa, los puntos asociados a su regulación son variados dado el complejo sistema genético que lo conforma. En esta tesis se decidió caracterizar los puntos de regulación que existen asociados a la síntesis de microcina E492 estudiando la regulación de la expresión de los genes mceBA, codificantes para la proteína de inmunidad y de microcina E492, respectivamente. Ambos genes conforman una sola unidad transcripcional, cuyo promotor esta rio arriba de mceB. Utilizando una fusión de la unidad mceBA con lacZ (MceBA'-'LacZ) se pudo establecer que la expresión aumenta de dos a tres veces en fase estacionaria de crecimiento. Este aumento en fase estacionaria responde a un promotor interno en el gen mceB, el cual aumenta la transcripción de mceA en fase estacionaria, determinado por qRT-PCR, lo cual lleva a un aumento en los niveles de MccE492 en esta misma fase. Por otro lado, la expresión trascripcional y traduccional de mceB es constitutiva. Fusiones traduccionales de lacZ a distintas regiones de la unidad mceBA y análisis transcripcionales permitieron plantear un modelo donde la estabilidad del ARNm de esta unidad transcripcional dependería de la eficiencia o acoplamiento traduccional de ambos ORFs. Una fusión de lacZ al primer codón de mceB generó valores de expresión traduccional similares a los de las fusiones de lacZ a distintas regiones internas de mceA. Sin embargo, fusiones de lacZ a los codones 21, 86 y 95 de mceB generaron valores de expresión traduccional notablemente menores a los de la fusión de lacZ al primer codón de mceB. La disminución traduccional observada se corresponde con una diminución en los niveles de ARNm. Al parecer si mceA no es traducido la estabilidad del ARNm de la unidad mceBA disminuye. Se estudio el efecto de los productos genicos del sistema productor de MccE492 sobre la expresión de los genes mceBA y se estableció mediante ensayos de Miller e inmunoblot que el producto codificado en el gen orfX, tiene un efecto represor sobre la expresión de la fusión MceBA'-'LacZ. Este efecto se corresponde con una menor producción de MccE492 activa, lo cual se estableció al observar una disminución del tamaño de halos inhibición de crecimiento de una cepa productora de MccE492 activa transformada con un plásmido portador del gen orfX. Adicionalmente se observo que el hierro es determinante en la expresión de orfX. Es así que proponemos que la expresión de mceBA está determinada por hierro a través del efecto que este tiene sobre orfX. En su conjunto estos resultados ponen de manifiesto la complejidad asociada a la regulación de la expresión génica de la unidad transcripcional mceBA, donde existen elementos en cis, como promotores internos que generan patrones de regulación diferencial para la producción de MccE492, estructuras internas en mceBA que generan un grado de regulación post-transcripcional a nivel de la estabilidad del ARNm que sería dependiente de la traducción de ambos ORFs y regulación en trans por algunos de los mismos componentes del sistema productor de MccE492, como es OrfX.

Microcin E492 is a low molecular mass bacteriocin produced by Klebsiella pneumoniae of RYC492. Bacteriocin production is a determinant phenomenon in the dynamics microorganism populations. Production of active microcin E492 requires several control points because of the complexity of its genetic system. The regulation of gene expression of mceBA genes, encoding to immunity protein and MccE492 respectively, was characterized. Both genes conform a transcriptional unit. Using translational fusions of lacZ to mceBA it was observed that the expression of these genes increased about twO three times in stationary phase. This increase was due to an internal promoter in the mceB gene that allowed the increase of mceA transcription in stationary phase, assessed by qRT-PCR experiments. The rise in mRNA level for mceA gene generated the increment of MccE492 production in this phase, meanwhile the mRNA and protein level for mceB gene were constitutive in exponential and stationary phase. 이 lacZ fusions to different regions of mceBA unit and transcriptional analysis allowed to establish a model in which the mRNA stability of this unit rely of translational coupling of both ORFs. lacZ fusion to the first codon of mceB gene generated similar gene expression values than these fusions to internal regions of mceA gene. However, lacZ fusions to codons 21, 86 and 95 of mceB gene decreased the translational expression compared to lacZ fusion to first codon of mceB. This variation was also seen at a transcriptional level. It seems that the absence of mceA translation diminishes mRNA stability of the mceBA unit. We characterized the effect on the expression of mceBA of the gene products of microcin E492 system. We established that the product encoded by orfx gene is a repressor of mceBA gene expression, consequently decreasing the production of active MccE492. orfX expression is affected negatively by iron concentration, and in turn, if iron decreases orfx expression increases affecting mceBA gene expression Altogether our results show the complexity of the gene expression regulation of mceBA genes. There are cis elements, like internal promoters that allow a differential regulation of MccE492 production, compared to the immunity production, internal structures in mceBA that regulate the mRNA stability, dependent on translation of both ORFs, and trans elements like OrfX from the microcin E492 genetic system.