Caracterización funcional del gen Fitocromo A (DcPHYA) y su rol en la síntesis de carotenoides en la raíz de reserva de zanahoria (Daucus carota)

Abstract

La fotomorfogénesis se refiere a procesos fisiológicos que se desencadenan en presencia de luz y que permiten el desarrollo normal de una planta luego de germinar, lo que se acompaña con un aumento en la síntesis de pigmentos, como carotenoides y clorofilas, requeridos para la fotosíntesis. Mientras que la escotomorfogénesis es cuando una planta germina y crece en oscuridad presentando un fenotipo etiolado, caracterizado por un hipocótilo largo y escasa síntesis de pigmentos. A nivel molecular, cuando las plantas crecen en oscuridad los fitocromos (PHYs) están inactivos en el citoplasma, mientras, que, en el núcleo, miembros de la familia de factores de interacción del fitocromo (PIF) se unen a elementos de respuesta a luz (LRE), situados en los promotores de genes asociados a la síntesis de carotenoides, reprimiendo su expresión. Por otro lado, cuando las plantas perciben la luz blanca (LB) (proceso de de-etiolación), los PHY se activan y traslocan al núcleo de la célula, donde fosforilan a los PIF, lo que conduce a su degradación. Esto último posibilita que a los LRE se unan factores de transcripción del tipo Long Hypocotyl 5 (HY5), que contribuyen a aumentar la expresión de genes relacionados con la síntesis de carotenoides como PSY. Procesos similares ocurren durante la maduración de frutos que aumentan el contenido de carotenoides bajo un crecimiento en LB. Por el contrario, en la zanahoria (Daucus carota) que es la 7° hortaliza con mayor superficie de plantación a nivel nacional (ODEPA, 2020), se sintetizan y acumulan grandes cantidades de carotenoides en su raíz crecida bajo tierra, en donde tal como en Arabidopsis (Arabidopsis thaliana), podría llegar una proporción baja de luz roja versus luz roja lejana (LR/LRL). A esto se suma el hecho que bajo LB la raíz de reserva de zanahoria no se desarrolla normalmente, presentando escaso crecimiento secundario, bajo contenido de carotenoides y disminuida expresión de genes carotenogénicos. Mediante un análisis de RNA-seq en nuestro grupo de investigación se comparó los perfiles de expresión génica entre una porción de raíz de reserva crecida en LB versus una porción de la raíz de reserva crecida bajo tierra. Se encontraron genes asociados a la señalización mediada por luz más expresados en la porción de raíz crecida bajo tierra que la expuesta a LB, tales como DcPHYA, DcPAR1, DcCOP1, DcCOP9, DcPIF3, DcPHYB-like. En Arabidopsis (Arabidopsis thaliana), fitocromo A (PHYA) participa en la fotomorfogénesis en sombra al activarse en baja proporción de LR/LRL, donde producto de su acción reprime la excesiva elongación del hipocotilo y favorece la síntesis de carotenoides. En frutos, PHYA activa la síntesis de clorofila y carotenoides. Además, tanto en Arabidopsis, como en frutos de tomate, regula positivamente la expresión de PSY. Tomando en cuenta los antecedentes anteriormente expuestos se estudió funcionalmente el gen DcPHYA de zanahoria y se determinó su rol en la síntesis de carotenoides. A partir de los resultados obtenidos se determinó que DcPHYA comparte un 73,19% de similitud de secuencia aminoacídica con AtPHYA, lo que nos indica que fitocromo A de zanahoria podría ser una proteína funcional. Como primera aproximación para estudiar funcionalmente el gen DcPHYA, lo expresamos de manera estable en tabaco. Seleccionamos las líneas expresoras de DcPHYA EL4, EL6 y EL7 y éstas fueron sometidas a tratamientos con LRL. Demostramos que DcPHYA en LRL actúa inhibiendo la elongación del hipocotilo por lo tanto, promoviendo la fotomorfogenesis. Además, regula negativamente la expresión relativa de los genes NtPEPCK y NtPar1-like. Aunque en este tratamiento, DcPHYA no regula positivamente el contenido de pigmentos como carotenoides y clorofilas ni la expresión relativa de los genes carotenogenicos NtPSY1 y NtPSY2. Como segunda aproximación para estudiar funcionalmente a DcPHYA, silenciamos el gen en plantas de zanahoria y analizamos su efecto en la raíz de reserva crecida bajo tierra. Obtuvimos 7 líneas de zanahoria transformantes para DcPHYA de las cuales seleccionamos la línea ASL2, ASL5, ASL9 y ASL11, que tienen un 86%, 54%, 40% y 27% de silenciamiento del gen, respectivamente. En las 4 líneas analizadas se encontró una menor expresión relativa de DcPSY1, lo que se correlacionó con el menor contenido de carotenoides totales. Mientras que en las líneas ASL2, ASL9 y ASL11 tuvieron menor expresión relativa de DcPSY2. Por otro lado, la expresión relativa de los genes DcLCYB1, DcLCYB2 y DcPAR1 no se vio afectada por el silenciamiento del gen DcPHYA. Basados en los antecedentes anteriormente expuestos, sugerimos que DcPHYA es activo en LRL, regulando el largo del hipocotilo y la expresión relativa de genes de manera positiva o negativa. Además, DcPHYA en la raíz de reserva de zanahoria crecida bajo tierra regula la síntesis de carotenoides a través del aumento en la expresión de PSY1.

Photomorphogenesis refers to physiological processes that are triggered in the presence of light and that allow the normal development of a plant after germination, which is accompanied by an increase in the synthesis of pigments, such as carotenoids and chlorophylls, necessary for photosynthesis. On the other hand, scotomorphogenesis is when a plant germinates and grows in the dark, presenting an etiolated phenotype, characterized by a long hypocotyl and poor pigment synthesis. At the molecular level, when plants grow in the dark, Phytochromes (PHYs) are inactive in the cytoplasm, while, in the nucleus, members of the Phytochrome Interacting Factor (PIF) family bind to Light Response Elements. (LRE) located in the promoters of genes associated with the synthesis of carotenoids, repressing their expression. On the other hand, when plants perceive White Light (WL) (deethiolation process), PHYs are activated and translocate to the cell nucleus, where they phosphorylate PIFs, leading to their degradation. This allowed that under LREs can bind transcription factors how Long Hypocotyl 5 (HY5), which increased the expression of genes related to the synthesis of carotenoids, such as PSY. Similar processes occur during fruit ripening were increased carotenoid content under WL growth. On the contrary, in the carrot (Daucus carota), which is the 7th vegetable with the largest plantation area at the national level (ODEPA, 2020), carotenoids are both synthesized and accumulate in its traproot grown underground. In Arabidopsis (Arabidopsis thaliana), a low ratio of Red Light versus Far Red light (R/FR) could arrive. While, in WL traproot of carrot does not develop normally, presenting little secondary growth, both low content of carotenoids and decreased expression of carotenogenic genes. Through an RNA-seq analysis in our research group, the gene expression profiles were compared between a portion of the reserve root grown in WL versus a portion of the reserve traproot grown underground. Genes associated with light signaling were found more expresed in the root portion grown underground that exposed to WL, such as DcPHYA, DcPAR1, DcCOP1, DcCOP9, DcPIF3, DcPHYB-like. In Arabidopsis (Arabidopsis thaliana), Phytochrome A (PHYA) participates in shadow photomorphogenesis by being activated in a low proportion of R/FR, where as a product of its action it represses the excessive elongation of the hypocotyl and favors the synthesis of carotenoids. In fruits, PHYA activates the synthesis of chlorophyll and carotenoids. In addition, both in Arabidopsis and in tomato fruits, it positively regulates the expression of PSY. Taking into account the above background, the carrot DcPHYA gene was functionally switched off and its role in carotenoid synthesis was prolonged. We found that DcPHYA shares a 73.19% similarity of amino acid sequence with AtPHYA, which indicates that carrot phytochrome A could be a functional protein. As a first approach to functionally study the DcPHYA gene, we expressed this gene in tobacco. We selected EL4, EL6 and EL7 lines and these were subjected to FR treatments. We show that DcPHYA in LRL acts by inhibiting hypocotyl elongation, thus promoting photomorphogenesis. Furthermore, it negatively regulates the relative expression of the NtPEPCK and NtPAR1-like genes. Although in this treatment, DcPHYA does not positively regulate the content of pigments, such as both carotenoids and chlorophylls and the relative expression of the carotenogenic genes NtPSY1 and NtPSY2. As a second approach to functionally study DcPHYA, we silenced the gene in carrot plants and analyzed its effect on traproot ground-grown. We obtained seven transgenic carrot lines. We selected the ASL2, ASL5, ASL9 and ASL11 lines, which have 86%, 54%, 40% and 27% gene silencing, respectively. In the 4 lines analyzed, a lower relative expression of DcPSY1 and DcPSY2 was found, which correlated with the lower content of total carotenoids. Three lines had les relative expression of DcLCYB1 in compared with Wt line. On the other hand, the relative expression of DcLCYB2 and DcPAR1 genes was not affected by DcPHYA gene silencing. Based on the background set forth above, we suggest that DcPHYA is active at FR, regulating hypocotyl length and relative gene expression in a positive or negative manner. In addition, DcPHYA in traproot carrot grown underground regulates carotenoid synthesis through increased expression of DcPSY1 and DcPSY2.