Estudios estructurales de la hemocianina de Concholepas concholepas: un enfoque combinado de las técnicas de cristalografía de rayos X y CRYO-EM

Abstract

Las hemocianinas son glicoproteínas multiméricas cilíndricas de alto peso molecular que se encuentran disueltas libremente en la hemolinfa de moluscos y artrópodos. Las hemocianinas de molusco se encuentran entre las proteínas más grandes conocidas, con masas moleculares entre 3,3 a 13,5 MDa, y presentan una compleja organización estructural. Su estructura cuaternaria corresponde a un didecámero, formado por una o dos subunidades distintas (homodidecámero y heterodidecámero respectivamente), y, a su vez, cada subunidad está formada por 8 dominios globulares con centros de unión a cobre llamados unidades funcionales (FU). Actualmente, las hemocianinas son usadas en aplicaciones biomédicas y clínicas como inmunoestimulantes naturales, no tóxicos y no específicos. En este contexto, en Chile se ha determinado que la hemocianina del gastrópodo litoral Concholepas concholepas (CCH) posee características que la hacen más efectiva que las de otras especies en inducir respuestas inmunológicas en estudios preclínicos de inmunocastración y vacunas contra cáncer prostático. Sin embargo, a la fecha, no hay información empírica reportada acerca de su estructura. Solo se dispone de caracterizaciones bioquímicas que indican que CCH corresponde a un heterodidecámero, con dos subunidades diferentemente glicosiladas, llamadas CCHA (405 KDa) y CCHB (350 KDa). Más aún, casi la totalidad de la secuencia de CCH permanece desconocida. Por ello se propuso obtener la estructura cristalográfica de al menos una FU de origen recombinante a partir de los 2 fragmentos de secuencias disponibles y determinar la organización tridimensional de las subunidades en un mapa del heterodidecámero de CCH, obtenido por cryo-EM. Dado que no fue posible obtener una FU expresada de manera recombinante en E. coli, se purificó una FU silvestre a partir de la subunidad CCHB de CCH y se determinó su estructura cristalográfica con resolución atómica (1,5 Å). Esto permitió obtener su secuencia, identificándola como CCHB-g, permitió determinar un árbol de N-glicosilaciones identificando la presencia de monómeros de fucosa, siendo la primera estructura tridimensional de FU de hemocianina en presentar este tipo de glicosilación, y, además, permitió analizar en detalle las distancias y ángulos de las interacciones químicas presentes en el centro de unión a cobre. La comparación de este centro con el presente en la estructura cristalográfica de FU de hemocianina de pulpo reportada a 2,3 Å de resolución reveló diferencias de hasta 0,3 Å en distancias y de hasta 11° en ángulos de enlace. Por otra parte, se obtuvo un mapa de cryo-EM de CCH a resolución cercana a la atómica (3,2 Å) que corresponde al mapa de mayor resolución reportado para una hemocianina de molusco. Además, utilizando la estructura cristalográfica de la FU, generamos el primer modelo de organización de subunidades de una hemocianina heterodidecámerica, situando las subunidades CCHA hacia ambos extremos del cilindro del didecámero y las subunidades CCHB ubicadas hacia el interior del cilindro. La información estructural presentada en este trabajo no solo será fundamental para las futuras aplicaciones de CCH en medicina y biotecnología, sino que será un aporte para el estudio estructural de las hemocianinas de molusco.

Hemocyanins are giant, cylindrical, multimeric proteins present in the hemolymph of mollusks and arthropods. Mollusk hemocyanins are one of the largest known proteins with a molecular mass of between 3.3 and 13.5 MDa, presenting a complex structural organization. Their quaternary structure corresponds to a didecamer formed by one or two subunits (homodidecamer and heterodidecamer, respectively), each of which is composed of eight globular domains containing copper centers called functional units (FU). Nowadays, hemocyanins are used as natural, non-toxic, and non-specific immunostimulants in biomedical and clinical applications. In this context, in Chile, it has been determined that the hemocyanin from the gastropod Concholepas concholepas (CCH) possesses unique properties that make it more effective than hemocyanins from other species in inducing immunological responses, as observed in preclinical studies of immunocastration and prostatic cancer vaccines. However, to date, there has been no empirical information reported about its structure. There are only biochemical characterizations indicating that CCH corresponds to a heterodidecamer with two differentially glycosylated subunits called CCHA (405 KDa) and CCHB (350 KDa). Moreover, almost the entire sequence of CCH remains unknown. Therefore, we proposed obtaining the crystallographic structure from at least one FU recombinantly expressed based on the two sequence fragments available and determining the three-dimensional organization of the subunits in a map of the CCH heterodidecamer obtained by cryo-EM. Because a recombinantly expressed FU could not be obtained from E. coli, we purified a wild-type FU from the CCHB subunit of CCH and determined its crystallographic structure at atomic resolution (1.5 Å). The structure allowed us to obtain the sequence, identifying the FU as CCHB-g. It also allowed us to determine an N-glycosylation tree, identifying the presence of fucose monomers, being the first three-dimensional structure of an FU with this type of glycosylation, and finally, allowing us to analyze in detail the distances and angles of the chemical interactions present in the copper-binding center. Its comparison with the copper-binding center of the crystallographic structure of octopus hemocyanin FU reported at 2.3 Å resolution reveals differences of up to 0.3 Å in distance and up to 11° in angles. On the other hand, a near-atomic resolution cryo-EM map of CCH (3.2 Å) was obtained which corresponds to the highest resolution map reported to date for a mollusk hemocyanin. Moreover, using the FU crystallographic structure, we generate the first subunit organization model of a heterodidecameric hemocyanin, placing the CCHA subunits towards the outer ends of the didecameric cylinder and the CCHB subunits at the inner part of the cylinder. The structural information presented in this work will not only be essential for future applications of CCH in medicine and biotechnology, but also contribute to the structural study of mollusk hemocyanins.