Estudio de la interacción de la polimerasa de rotavirus VP1 con el templado de RNA y las proteínas no estructurales NSP2 y NSP5

Abstract

El rotavirus miembro de la familia Reoviridae, es un virus con 11 segmentos de RNA de doble hebra y es el agente principal causante de la diarrea en niños menores de cinco años. El rotavirus es aún un problema de salud a nivel mundial, responsable de 600.000 muertes anuales, presentándose estos eventos fatales en su mayoría en países en vías de desarrollo. La etapa de replicación y encapsidación del genoma de rotavirus ocurre en los Ilamados viroplasmas, estos son estructuras electrodensas presentes en el citoplasma de células infectadas. Las proteínas claves en la formación de los viroplasmas son dos proteínas no estructurales (NS), NSP2 y NSP5. NSP5 es una proteína codificada por el gen 11 de rotavirus. Es una proteína dimérica que en las células infectadas es fosforilada y glicosilada. NSP5 tiene afinidad por RNA de simple (sSRNA) y doble hebra (dsRNA). NSP2 es una proteína básica de 35 kDa y posee una estructura octamérica, la cual es su forma biológicamente activa. Dentro de las funciones descritas para NSP2 se encuentran: actividad desestabilizadora de doble hélice, NTPasa y RTPasa. NSP2 une de manera inespecífica ssRNA. Aún no es muy claro el papel de NSP5 en el ciclo viral, se sabe que las dos proteínas NS son esenciales en la replicación del genoma viral. VPI es una proteína de 125 kDa y es la polimerasa viral RNA dependiente (RdRP), tiene la capacidad de unirse de manera inespecífica al extremo 3' del RNA templado viral, pero necesita de la proteína VP2 para su actividad replicasa. Se sabe que NSP2 y NSP5 interactúan con la polimerasa de rotavirus, VP1. Además estas tres proteínas están presentes en los viroplasmas y forman parte de los intermediarios de replicación, RI. En la morfogénesis del rotavirus los eventos concernientes a la encapsidación y posterior replicación del genoma viral no están plenamente dilucidados. Por consiguiente en este trabajo proponemos un método de estudio in vitro, con las proteínas involucradas en las primeras etapas de la morfogénesis del rotavirus: NSP2, NSP5, VPI y el RNA templado. Visualizamos la formación de complejos individuales de sSRNA-proteína o proteína-proteína (para el caso de las NS), mediante microscopía de fuerza atómica, AFM. La ventaja de esta técnica permitió usar la molécula completa de un transcrito del gen 8 de rotavirus (1.058 nucleótidos) y observar de manera directa una conformación muy particular que llamamos forma de Y. Uno de nuestros resultados mas interesantes se obtuvieron con los complejos formados por VP1 y la molécula completa del ssRNA del gen 8 de rotavirus, en donde aparece la proteína VP1 unida a sitios específicos del RNA en forma de Y, las cuales involucraron no solo regiones del extremo 3', sino también regiones no conservadas del sSRNA, estas últimas pueden ser la clave en la encapsidación del ssRNA. Los análisis de las proteínas NS con el ssRNA mostraron diferencias en el modo de unirse de estas proteínas en el templado de RNA, en donde NSP2 se distribuyó a lo largo de la molécula del RNA cubriéndola casi en su totalidad. Esta forma de unión de NSP2 al sSRNA, se asocia a una actividad desestabilizadora de doble hélice previamente reportada. NSP5 produjo un efecto de compactación en el ssRNA y/o agregación, en contraste a los ensayos de NSP5 con el dsRNA genómico del rotavirus, en donde la proteína se distribuyó de forma continua en el dsRNA de manera similar a las cuentas de un collar. Esta última observación posibilita la hipótesis que NSP5 evita la detección en la célula hospedadora del dsRNA viral. También se observó una agregación del sSRNA al interactuar simultáneamente con las proteínas NSP2-5, lo cual no permitió evidenciar si los sitios ocupados por VP1 en el ssRNA en forma de Y, eran comunes a las proteínas NS. En ausencia del ssRNA templado, los complejos de NSP2-NSP5 no formaron agregados, en cambio aparecieron complejos donde sólo monómero del dímero de NSP5 se unió al octámero de NSP2. The rotavirus of the family Reoviridae is a virus with 11 double-stranded RNA segments and is the main causing agent of diarrhea in children that are less than five years old. This rotavirus is still a health problem worldwide, and is responsible for 600,000 deaths per year, being most fatal in developing countries. The replication and packaging stage of the viral genome occurs in the so-called viroplasms, which are electrodense structures present in the cytoplasm of infected cells. The key proteins in the formation of the viroplasms are two non-structural (NS) proteins, NSP2 and NSP5. NSP5 is a protein coded by gene 11 of rotavirus. It is a dimeric protein that is phosphorylated and glycosylated in infected cells. NSP5 has affinity for single and double-stranded RNA. NSP2 is a basic 35 kDa protein shaped as an octamer, and is biologically active. The functions described for NSP2 include: double helix-destabilizing activity, NTPase and RTPase. NSP2 possess sequence independent affinity for single stranded ssRNA. Even though the role of NSP5 in the viral cycle is not yet clear, it is well known that both NS proteins are essential for the replication of viral genome. VP1 is a 125 kDa protein and is an RNA-dependant polymerase (RdRP), which can specifically binds to the 3 end of the RNA template, but needs the VP2 protein for its replicase activity. It is known that NSP2 and NSP5 interact with the viral polymerase VP1. In addition, these three proteins are present in the viroplasms and are part of the replication intermediaries, RI. In the rotavirus morphogenesis the events concerning packaging and later replication of the viral genome are not fully understood. Here we propose an in vitro study method with the proteins involved in the first stages of rotavirus morphogenesis: NSP2, NSP5, VP1 and the template RNA. The interaction of the individual ssRNAprotein or protein-protein (in the case of NS) complexes was visualized, through atomic force microscopy (AFM). The advantage of this technique was that it allowed to use the complete molecule of a transcript of the rotavirus gene 8 (1058 nucleotides) and directly observe a very particular conformation that was called Y shape. Some ofthe most interesting results were obtained with the complexes formed by VP1 and the full ssRNA of gene 8, in which VP1 appears bound to specific sites in the RNA in a Y shape, apparently involving 3'end regions conserved and none conserved. The analyses of NS proteins with the ssRNA showed differences in the binding of these proteins with the RNA template, where NSP2 is distributed throughout the length of the RNA molecule, covering it almost completely. These bind mode is probably due to its helix-destabilizing activity. NSP5 caused a compacting or aggregation effect in the RNA that made the complexes difficult to study. In contrast the NSP5-dsRNA complexes suggest the possible function of NSP5 to prevent the detection of dsRNA in infected cell. The NSP5/NSP2/ssRNA complexes also caused aggregation, thus it was not possible to determine with certainty whether the sites occupied by VP1 in the sSRNA were common to the NS proteins.