Desarrollo inicial de mamíferos : efecto de la inhibición del cambio celular y de la replicación del DNA sobre el patrón de síntesis proteíca

Abstract

Durante el desarrollo preimplantacional de los mamiferos ocunen al menos dos procesos morfogenéticos importantes: compactación y blastulación. E1 primero se reconoce en el embrión de 8 células porque cada una pierde su forma esférica al aumentar el área de contacto con sus vecinas llegándose a formar un embrión esférico. El segundo, blastulación o formación del blastocisto, se reconoce en el embrión de 24 a 50 células por el desarrollo de una cavidad interna circundada por dos poblaciones celulares, masa interna y trofectoderma, que se diferencian por su morfología y destino. Antes de la formación del blastocisto no hay diferenciación celular en el sentido convencional de diferenciación espacial ya que las células del embrión son iguales entre si por su morfologia y determinación; sin embargo, hay diferenciación temporal puesto que las propiedades de las células en cada ciclo son diferentes de las propiedades de las células del ciclo anterior. La diferenciación temporal, simultánea con cambios morfológicos, como multiplicación celular y compactación, se reconoce por cambios en el patrón de sintesis protéica. Se han propuesto y examinado experimentalmente distintos mecanismos reguladores de la sintesis de proteinas en el embrión preimplantacional de ratón y ha podido descartarse la participación de las divisiones celulares, las divisiones nucleares, el número de células, el tamaño del embrión y la relación núcleo/citoplasma. En esta Tesis proponemos otros dos mecanismos posibles de regulación: 1) La sintesis de proteínas podria ser regulada por los cambios de los contactos o de la forma celular que ocurren durante la compactación. Esta proposición se basa en que en otros sistemas se ha deserito que una gran variedad de proteinas es regulada tanto a nivel transcripcional como traduccional por los cambios de forma o el establecimiento de contactos celulares, sugiriéndose que el mecanismo de regulación involuera a1 citoesqueleto. 2) La sintesis de proteinas podria ser regulada a nivel transcripcional o por los ciclos de replicación del DNA o por ambos a la vez. La regulación transcripcional de la sintesis de proteinas está bien comprobada y la necesidad de replicación del DNA para que la sintesis protéica sea normal ha sido demostrado en distintos sistemas, incluido el embrión preimplantacional de ratón aunque sólo durante el estado de una a dos células. Con el fin de poner a prueba las distintas proposiciones hemos establecido métodos para sineronizar el desarrollo de una población de embriones y observar las modificaciones durante la compactación. Luego se inhibió con diferentes procedimientos cada uno de los dos mecanismos reguladores propuestos y se analizó por electroforesis uni o bidimensional en geles de poliacrilamida, el efecto de la inhibición sobre el patrón de proteinas sintetizadas por embriones previamente incubados con 35S-metionina. Nuestros resultados pueden resumirse como sigue: 1) Inhibición de la compactación. EGTA, un quelante de Ca+, inhibe la compactación y modifica en forma bastante generalizada el patrón de sintesis de proteinas, retrasando o inhibiendo totalmente la sintesis de diversos polipéptidos. Es posible que parte del efecto de EGTA sea inespecifico, al modificar procesos celulares dependientes de Ca+ que no están relacionados con la compactación. Concanavalina A (Con A), una lectina que se une a moléculas de superficie e interfiere con la compactación, induce cambios mucho más definidos en el patrón de sintesis de proteinas. Como algunos de estos cambios no se observan con los otros agentes descompactantes, podrian estar asociados a la activación por Con A de receptores de superficie que afectan la regulación de la sintesis de proteins independientemente de la compactación. Citochalasina, (CCD), a-Lactalbúmina (a-La), que interfieren con la compactación al inhibir el citoesqueleto y la B-galactosiltransferasa respectivamente, indujeron cambios semejantes (aumento o disminución) en el 75% de los 141 polipéptidos analizados en geles bidimensionales, de 1o cua1 puede concluirse que el 25% de las proteinas restantes probablemente son afectadas por estos tratamientos en una forma independiente de la compactación. Del total de polipéptidos analizados, hubo 14 cuya síntesis cambió durante la compactación, y de éstos sólo uno fue afectado cuando la compactación era inhibida por CCD o por a-La, lo que sugiere que este polipéptido podría ser regulado por la compactación. Como este caso admite otras interpretaciones puede concluirse que el conjunto de nuestros resultados revelan que los cambios de forma celular durante la compactación probablemente no representan un mecanismo regulador del patrón de síntesis de proteínas por nosotros estudiado. 2) Inhibición de la actividad nuclear. Los experimentos de inhibición de la transcripción por aamanitina sugieren que entre las y las 6 horas después de la compactación se sintetizan proteinas utilizando mRNAs transcritos previamente, puesto que no se observó efecto del inhibidor, 10 cual implica que los mRNAs pueden ser de larga vida y se traducen más tarde. Sin embargo, cuando la replicación del DNA fue inhibida por afidicolina durante el mismo periodo, el patrón de sintesis de proteina se modificó notablemente. Esto significa que dicho patrón podría estar regulado por ciclos de replicación en una forma independiente de la transeripoión. Cuando el tratamiento con afidicolina se prolongó hasta 24 horas después de la compactación, los embriones dejaron de sintetizar las proteinas que sintetizan los controles y además sintetizaron otras nuevas. Esto sugiere que el presunto "reloj" de la sintesis de proteinas, que regularía los cambios temporales, no es detenido al detener la replicacón del DNA sino que funciona anormalmente, lo cual sugiere que la regulación de la sintesis de proteínas seria dependiente, pero no en forma exclusiva, de los ciclos de replicación del DNA. En conclusión: 1) Una regulación de la síntesis de proteinas por cambios de los contactos o de la forma celular que ocurren durante la compactación no es confirmada por nuestros resultados. 2) Una regulación de la síntesis de proteinas por ciclos replicación del DNA es compatible con nuestros resultados.

During early development of mammals, at least two important morphogenetic processes are detected: compaction and hlastulation. The former is recognized in 8-cell embryos because hlastomeres lose their semispherical form as they flatten against each other and the embryo acquires a spherical contour. The latter is recognized in embryos having 24 - 50 cells asa hlastocoel is formed surrounded hy inner mass cells and trophoblast cells, which are different regarding their actual properties and their fate. Prior to blastulation there is no cell differentiation, in the conventional sense of spatial differentiation, but temporal differentiation becomes evident if cell properties in successive cell cycles are compared. This temporal differentiation has been detected by changes in the pattern of protein synthesis. Diverse mechanisms involved in the regulation of protein synthesis in preimplantation embryos have been suggested and later discarded experimentally. Among these, the role of cell division, nuclear division, numher of cells, embryo size and nucleus/cytoplasm ratio. Here we examine the role of changes in cell form or contact and the role of transcription or replication. 1. The effect of changes in cell form or cell contact on protein synthesis, through trancriptional or post-transcriptional mechanisms, has been described in a variety of cell types in vitro and the cytoskeleton seems to be basically involved; a regulation of this kind might operate during compaction. 2- The effect of DNA replication on protein synthesis has also been descrihed in different models, including in the mouse embryo at the 2-cell stage, and this kind of regulation might also operate in later stages. In order to test these two proposals we have first established methods that synchronize development during compaction. In synchronized embryos we tested the effect of drugs that interfere with compaction and drugs that interfere with DNA replication or with transcription. The pattern of protein synthesis was studied by incubating embryos with 3Smethionine and performing one- and two-dimensional electrophoresis. Our results can he summarized as follows. 1. Inhihition of compaction. EGTA affects the pattern of protein synthesis by retarding or preventing the synthesis of several polypeptides. However, these effects might be due to chelation of Ca+ and not to specific changes in cell form or contact. Con A interferes with compaction and causes precise changes in the pattern of protein synthesis. However, since some of the changes are not observed with other decompacting agents, all changes may not be ascribed to changes in form but rather to activation of Con A receptors on the cell surface. Cytochalasin D (CCD) and alpha-lactalbumin (a-La), which interfere with compaction through inhibition of the cytoskeleton and of B-galactosyltransferase, respectively, induce similar changes in 75% of the polypeptides analyzed and therefore, other proteins changes may not he caused by decompaction. Of all polypeptides analyzed, only the synthesis of 14 changes during compaction and out of these only 1 is affected similarly by CCD or a-La thus suggesting that its synthesis might be regulated by compaction. However, this observation also fits in with other possihle interpretations and we would conclude that changes in cell form during compaction probably do not regulate the pattern of protein synthesis. 2. Inhibition of DNA replication or transcription. Inhihition of transcription hy a-amanitin suggest that proteins synthesis between 0 and 6 h postcompaction is based on mRNA's transcribed previously as the inhibitor does not affect the pattern. However, the inhibition of DNA replication by aphidicolin during the same period causes a distinct change of the pattern which means that its regulation by DNA replication does not depend on transcription. When aphidicolin treatment is extended up to 24 h postcompaction, the proteins found in control embryos are not detected but other proteins are observed thus suggesting that the developmental clock which prohably regulates temporal differentiation works abnormally hut is not completely arrested by the drug. Our results allow us to conclude: 1. That we have not ohserved a distinct effect on the pattern of protein synthesis caused hy changes in cell form or cell contacts during compaction. 2. That cycles of DNA replication are probably involved in the regulation of the patterns of protein synthesis.