Rol de la proteína Rev en el reclutamiento de factores celulares que promueven la síntesis de Gag del Virus de la Inmunodeficiencia Humana de tipo 1 (VIH-1)

Abstract

Durante la infección causada por el virus de la inmunodeficiencia humana del tipo 1 (VIH-1), el ADN proviral es integrado en el genoma celular y luego la ARN polimerasa II sintetiza un único transcrito de 9-kb denominado ARNm completo (ARNmc) del cual se obtienen 3 clases de transcritos por medio de su corte y empalme alternativo. En un inicio, se generan transcritos de 2-kb que poseen corte y empalme total y son utilizados para producir las proteínas reguladoras Tat, Rev y la proteína accesoria Nef. Posteriormente, se acumulan los transcritos de 4-kb con corte y empalme parcial de los cuales se obtienen las proteínas Vif, Vpr, Vpu y Env. La síntesis de las proteínas estructurales Gag y Gag-Pol se realiza a partir del ARNm completo (ARNmc) de 9-kb que no sufre corte y empalme. Los ARNm celulares y los transcritos de 2-kb son sometidos a corte y empalme siguiendo una vía de expresión génica canónica, donde el reclutamiento del complejo de unión al cap nuclear (CBC) y el complejo de unión del exón (EJC) favorece las tasas de exportación nuclear y traducción. Sin embargo, dado que el ARNmc debe evitar el corte y empalme para poder ser utilizado como matriz para la síntesis de Gag y Gag-Pol, éste no puede seguir las vías de exportación nuclear canónicas propias del metabolismo de los ARNm celulares, ya que sería retenido hasta completar el corte y empalme o para ser degradado. Estudios previos han demostrado que la proteína viral Rev se une al ARNmc para asegurar su exportación hacia el citoplasma. Esto gracias a la asociación de Rev con el factor de exportación nuclear CRM1 junto a otros factores celulares que permiten la formación de un complejo ribonucleoproteíco (mRNP) competente para la exportación nuclear del ARNmc. Una vez en el citoplasma, este mRNP viral no canónico debe ser reconocido por la maquinaria traduccional celular para la síntesis de proteínas. En este trabajo se muestra que Rev favorece la síntesis de Gag al promover la exportación nuclear y la traducción del ARNmc. Mediante la técnica de ISH-PLA, observamos que el ARNmc se asocia a las proteínas celulares CBP80 y eIF4AI lo que favorece la síntesis de Gag, además determinamos que este proceso es mediado por la proteína Rev, de este modo establecimos que la vía de exportación mediada por RRE/Rev es importante para el reclutamiento de estas proteínas celulares. Por otro lado, analizamos por medio de microscopia, si los componentes del EJC formaban parte de un complejo con el ARNmc, de esta forma observamos que solo la helicasa de RNA eIFAIII colocalizaba con el ARNmc. Por medio de la técnica de RNA-IP observamos que, además, esta helicasa se asocia al ARNmc. Nuestros datos revelaron que la proteína viral Rev es capaz de reclutar a la proteína eIF4AIII a través del extremo C-terminal y forma un complejo ribonucleoproteíco con el ARNmc que favorece la síntesis de Gag. De esta manera, entregamos evidencia adicional sobre la composición ribonucleoproteica del ARNmc mediada por Rev para promover la síntesis de Gag

During HIV-1 infection, the RNA polymerase II drives the synthesis of a 9-kb transcript named full-length mRNA (FL mRNA) that is used as a template for alternative splicing to produce different classes of transcripts. In the early stages of viral gene expression, the 2-kb fully spliced transcripts are generated to synthesize the regulatory proteins Tat, Rev, and the accessory protein Nef. Later, the 4-kb partially spliced transcripts are accumulated and used for the synthesis of Vif, Vpr, Vpu and Env. Finally, Gag and Gag- pol polyproteins are synthesized from the usmRNA. Fully spliced viral mRNA follows the canonical gene expression pathway where the recruitment of the cap binding complex (CBC) and the exon junction complex (EJC) enhances the rates of nuclear export and translation. However, since the usmRNA avoids splicing to be used as the template for synthesis of Gag and Gag-Pol, this viral mRNA does not follow the canonical nuclear export pathway, because otherwise it would be retained and degraded in the host cell nucleus. Previous studies have shown that the viral protein Rev binds to the usmRNA to promote its export to the cytoplasm. This is possible by the interaction between Rev with the nuclear export factor CRM1 and together with other cellular factors that allow the formation of a ribonucleoprotein complex (mRNP) for the nuclear export of usmRNA. However, once in the cytoplasm, this non-canonical mRNP must be recognized by the translational machinery for protein synthesis. In this work, we show that Rev favors Gag synthesis by promoting nuclear export and translation of the usmRNA. Through the ISH-PLA technique, we observed that the HIV-1 usmRNA associates with the cellular proteins CBP80 and eIF4AI, which favors the synthesis of Gag. We also determined that the Rev protein drives this process, and the RRE/Rev export pathway is necessary for the recruitment of these proteins onto the viral RNA. On the other hand, we analyzed whether components of the EJC were components of the usmRNA ribonucleoprotein complex, in this way we observed that only the eIFAIII co-localized with the usmRNA. Through RNA-IP, we observed that this RNA helicase associates with the usmRNA. Our data show the Rev protein recruits the eIF4AIII protein through the C-terminus and forms a ribonucleoprotein complex with the usmRNA that favors Gag synthesis. Together, our results provide evidence to improve our understanding on the mRNP composition of the usmRNA and how Rev mediates this process to promote Gag synthesis