Transducción de las células 549 y MSC in vitro y de hepatocitos murinos in vivo con un vector adenoviral que contiene el gen ido

Abstract

Uno de los mayores problemas del uso de vectores adenovirales en terapia génica es la respuesta inmunológica que desarrolla el receptor contra el vector de transferencia génica y/o el producto de los transgenes movilizados por éste. Para prevenir o disminuir este efecto, se propone inducir tolerancia inmune selectiva en las células modificadas genéticamente. Para ello, se diseñó y construyó un vector adenoviral de primera generación que contiene la región codificante de la enzima indolamina 2,3 dioxigenasa (IDO). La expresión de esta enzima en la interfase materno-fetal es necesaria para garantizar la tolerancia del feto por la madre y sería un componente importante para mantener la tolerancia periférica a los antígenos propios. La enzima IDO cataliza el paso limitante en el catabolismo de triptófano, señal que determina la transición entre las fases del ciclo celular G1 a S de los linfocitos T activados. La ausencia de triptófano o la presencia de metabolitos originados de su degradación promueven apoptosis de los linfocitos T activados, resultando en la deleción de los clones de linfocitos T reactivos contra los antígenos que los activaron. Mediante el método de Volgestein (recombinación homologa), se construyeron los vectores AdGFP y AdIDO. Ambos vectores contienen el gen reportero que codifica para la proteína fluorescente verde (GFP) bajo el control del promotor constitutivo de citomegalovirus (CMV) y el terminador del gen B- actina. Además, AdIDO contiene el cDNA de IDO, bajo el control del promotor CMV y el terminador del gen ẞ- actina. Se evaluó in vitro la capacidad de los vectores adenovirales de transducir células humanas derivadas de carcinoma pulmonar (A549) y células troncales mesenquimaticas (MSC). Se constato que por microscopía de epifluorescencia las células expuestas a los distintos vectores expresaron GFP. En las células transducidas con el vector adenoviral AdIDO fue posible detectar a través de RT-PCR el mRNA de IDO. Adicionalmente la actividad catalítica de esta enzima fue determinada por la disminución de la concentración de triptófano en los medios de cultivo. La expresión de la enzima IDO provocó la inhibición de la proliferación celular en las células A549, pero no en las células MSC. La evaluación de los vectores adenovirales in vivo se realizó en ratones inmunocompetentes Balb/c inyectados por vía intravenosa y sacrificados a los 7, 14 y 21 días post-inyección. Se mostró que los vectores transducían células hepáticas a través de la expresión de GFP, la cual tanto para el vector AdIDO como AdGFP, tuvo un máximo de expresión a los 14 días post-transducción y una mínima expresión a los 21 días post- transducción. Al analizar cortes histológicos de hígado en estos animales se encontró que en ambos casos hubo presencia de grupos de células infiltrantes. Esto sugiere que ambos vectores promovieron una respuesta inmune del huésped. Se concluye que el vector AdIDO es capaz de transducir tanto células humanas como murinas y de expresar el transgen IDO. Este vector puede ser utilizado para ensayos in vitro e in vivo de inhibición de células del sistema inmune.

One of the mayor problems of the use of adenoviral vectors in gene therapy is the immune response that the host develops against the vector and/or the product of transgenes mobilized thereafter. In order to prevent or to diminish this effect we propose to induce selective immune tolerance in the genetically modified cells, For this purpose, we designed and constructed a first generation adenoviral vector that contains the encoding region of indolamine 2,3 dioxygenase (IDO).The expression of this enzyme in the fetal maternal interphase is necessary to ensure the tolerance of the fetus by the mother, and it is an important component to maintain the peripheric tolerance to the person's own-antigens. The reaction catalized by the enzyme is the limiting step in tryptophan catabolism, which determines the transition between G1 to S phases of the cellular cycle of activated T lymphocytes. The absence of tryptophan, or the presence of metabolites originated from its degradation, promotes apoptosis in activatedт lymphocytes resulting in the deletion of the clones of lymphocytes T that are reactive against the antigens that activated them. The AdGFP and AdIDO vectors were constructed by the method of Volgestein, (homologue recombination). Both vectors contain the reporter gene encoding for the green fluorescent protein (GFP) under the control of the constituent promoter of citomegalovirus (CMV) and the terminator of the B- actin gene. AdIDO contains also CDNA for IDO, under the control of the CMV promoter and the terminator of the ẞ-actin gene. The ability of the adenoviral vectors to transduce human cells derived from pulmonary carcinoma (A549) and mesenchymal stem cells (MSC) was evaluated. The cells exposed to the different vectors expressed GFP when analyzed by epifluorescence microscopy. In cells transduced with AdIDO, it was possible to detect the mRNA of IDO by RT-PCR, and the catalytic activity of this enzyme was determined by the decrease of tryptophan concentration in the culture medium. The expression of the enzyme IDO caused the inhibition of the cellular proliferation of A549 cells, but not of MSC cells. The evaluation of the adenoviral vectors in vivo was carried out in inmunocompetent Balb/c mice injected by intravenous route and sacrificed at days 7, 14 and 21 post-injection. We verified that the adenoviral vectors transduced hepatic cells since there was GFP expression. Both vectors had a maximum of expression at day 14 post-transduction and a minimum expression at day 21 post-transduction. When analyzing histological sections from the livers of these animals, we observed that with both adenoviral vectors there were groups of infiltrating cells, which suggests that both vectors elicited an immune response in the host. In conclusion, the AdIDO vector is able to transduce human cells as well as murine cells, and also to express the IDO transgene. This vector can be used for in vitro and in vivo assays of inmune system cell inhibition.