Síntesis y detección de las glicoproteínas del virus andes

Abstract

El síndrome cardiopulmonar por virus Hanta, descubierto en 1995 en Chile, es producido por el virus Andes el cual pertenece al género Hantavirus de la familia Bunyaviridae. Este virus se caracteriza por ser el más virulento dentro de este género, con un índice de mortalidad en humanos infectados de alrededor de un 30%. La principal vía de transmisión a los humanos ocurre por inhalación de aerosoles de heces, orina o saliva de roedores portadores del virus. El genoma del virus Andes está formado por tres hebras independientes de ARN de sentido negativo denominadas de acuerdo a su tamaño L, M, S por grande, medio y pequeño, respectivamente. Los estudios de esta memoria se enfocaron en el segmento М del genoma viral, el cual codifica para la proteína precursora de las glicoproteínas 1 y 2. Estas proteínas están insertas en la envoltura lipídica del virus e interactúan con los receptores celulares permitiendo la unión del virus a la célula hospedera. Se ha reportado que los virus Hanta que causan el síndrome cardiopulmonar interaccionan con las integrinas B1 y ẞ3. De la interacción entre las glicoproteínas estos receptores se ha sugerido que depende el desarrollo o no de la enfermedad. y En este trabajo, segmentos de proteínas G1 y G2 del virus Andes aislado CHI-7913 se expresaron en E. coli como proteínas de fusión a tioredoxina de E. coli. La proteína G1 fue expresada como proteína de fusión en dos segmentos, uno de la región amino denominado G1a'de aproximadamente 62 kDa y otro de la región carboxilo denominado G1ẞ de aproximadamente 58 kDa. Ambas proteínas están superpuestas en 15 aminoácidos. Se intentó producir la proteína G1 completa in vitro, obteniéndose una proteína de tamaño parcial de 30 kDa, la cual es reconocida por anticuerpos monoclonales contra la proteína G1. La proteína G2 se expresó también en dos mitades, una región amino de 45 kDa y una región carboxilo de 58 kDa respectivamente. Estas proteínas están superpuestas en 37 aminoácidos. Las proteínas recombinantes obtenidas fueron utilizadas para desarrollar anticuerpos monoclonales, los cuales reaccionaron específicamente con las proteínas recombinantes en ensayos de Inmunoblot. Los anticuerpos obtenidos contra G2 fueron analizados por su unión al virus en células Vero E6 infectadas con el virus Andes. Se identificaron 13 anticuerpos que se unen al virus, 11 contra G2a y 2 contra G2ẞ. Estos anticuerpos son herramientas poderosas que podrán ser usadas en el futuro para estudiar los mecanismos de infección viral y para fines diagnósticos y terapéuticos.

The hantaviral cardiopulmonary syndrome, discovered in 1995 in Chile, is produced by the Andes virus, which belongs to the Hantavirus genus of the Bunyaviridae family. This virus is known to be the most virulent of this genus, with a human mortality rate of around 30%. Transmission of this pathogen in humans is mainly through inhalation of aerosols from feces, urine and saliva of rodents bearing the virus. The Andes virus genome is composed of three independent negative-polarity singlestrand RNA molecules, termed L (large), M (medium) and S (small). The studies carried out in this thesis focus on the M segment, which codifies for the precursor of glycoproteins 1 and 2. These membrane proteins are inserted in the viral envelope and interact with cellular receptors, allowing the attachment of the virus to the host cells. It has been reported that Hantaviruses causing the pulmonary syndrome interact with ẞ1 and ẞ3 integrin receptors depending on the development or not of the disease, respectively. In this work, segments ofthe G1 and G2 proteins from the Andes virus isolate CHI-7913 were expressed in E. coli as fusions proteins with E. coli thioredoxin. G1 was expressed in two separate segments fused to thioredoxin, one from the amino, termed G1a, of approximately 62 kDa and the other one from the carboxy, termed G1B, of approximately 58 kDa. These proteins overlap by 15 amino acids. When expresing the complete G1 protein in vitro, only a partial fragment of 30 kDa was obtained, this was recognized by monoclonal antibodies against G1. The G2 protein was also expressed in two halves, an amino-terminal region of approximately 45 kDa and a carboxy region of 58 kDa. These proteins overlap by 37 amino acids. The recombinant proteins obtained were used for the development of monoclonal antibodies, which reacted specifically with the recombinant proteins by Inmunoblot analyses. The antibodies obtained against G2 were assayed by their binding to the virus in Andes virus-infected Vero E6 cells. Thirteen antibodies were identified that interacted with the virus, 11 against G2a and 2 against G2ẞ. These antibodies are powerful tools for future studies on the mechanism of viral infection and furthermore may be useful for diagnostic and therapeutic applications.