Clonamiento, expresión y desarrollo de un sistema de screening para aumento en la actividad de una lipasa activa a bajas temperaturas mediante evolucion dirigida

Abstract

Las nuevas industrias han incorporado el uso de enzimas psicrófilas dentro de sus procesos de producción, lo que les ha permitido reducir tanto el consumo de sustratos como la producción de compuestos tóxicos, además de ahorrar energía, permitiendo una disminución de costos e impacto ambiental y por ello un aumento en la rentabilidad del proceso. Estas enzimas tienen un alto potencial a nivel industrial biotecnológico, у dentro de éstas, las lipasas son foco de atención dada su alta capacidad de sintetizar e hidrolizar enlaces ésteres y su exquisita selectividad de sustratos. Sus aplicaciones involucran la producción de alimentos, detergentes, fármacos, cosméticos, síntesis de compuestos químicos como biopolímeros y agroquímicos y su uso como biosensores, entre otras. En este trabajo, el gen de la lipasa 2-17 adaptada a bajas temperaturas fue clonado en el vector de clonamiento pGEM-T Easy para luego ser incorporado al vector de expresión pMAL-c2E e integrado exitosamente en las cepas E. coli BL21(D3E) y TB1. Se seleccionó un clon que posteriormente fue inducido con IPTG 0,3 mM para expresar la proteína lipasa recombinante, obteniéndose una proteína de fusión soluble de aproximadamente 90 kDa, consistente con la suma de la lipasa de 47 kDa y de MBP de 43 kDa y que presentó actividad lipolítica una vez purificada. Mediante ensayos en medio líquido con el sustrato p-nitrofenil caprato se determinó que el valor de Km de esta enzima es de 9,75 mM. Esta lipasa de fusión recombinante se utilizó para desarrollar métodos de evolución dirigida. Para ello fue necesario optimizar el proceso de screening, desarrollar un método para la detección de actividad en medio líquido y adaptar la técnica mutagénica de PCR propenso a error para la lipasa. El protocolo seleccionado fue utilizando medio TB, a una temperatura de incubación de 18 °C durante 16 horas, con una concentración de IPTG de 0,5 mM en volumen de cultivo de 600 µL. El coeficiente de variabilidad obtenido para estas condiciones fue de 7,55%, considerado adecuando dentro del rango utilizado en la práctica. Se determinó que las condiciones de PCR propenso a error con una concentración de magnesio de 7 mM y una concentración de ADN molde de 0,05 ng/µL, generaron una tasa mutagénica adecuada, inactivando cerca del 50% de los clones. Se desarrolló una ronda de PCR propenso a error con el fin de obtener clones de la enzima que presenten actividad mejorada. Finalmente, se analizaron 400 clones en el primer ciclo y se obtuvieron 20 posibles clones positivos. Para seleccionar los mejores, se realizó un nuevo screening solo con los clones seleccionados y a partir de ellos se escogieron dos variantes. Éstos fueron secuenciados y serán analizados posteriormente. El mejor variante será caracterizado y podría ser seleccionado como molde para las siguientes rondas de mutagénesis.

Novel industries have incorporated the use of psychrophilics enzymes within their processes of production, which has allowed reduction in the consumption of substrates and the production of toxic compounds, besides saving energy, allowing a decrease of costs and environmental impact therefore an increase in the process yield. These enzymes have a high potential for the biotechnology industry, and within these, lipases are the center of attention due to their high capacity to synthesize and to hydrolyze esters bonds and their high selectivity for substrates. Their applications involve food production, detergents, drugs, cosmetics, synthesis of chemical compounds such as biopolymers and agro-chemicals, and their use as biosensors, among many others. In this work, the cold-active lipase 2-17 gene was cloned into the pGEM-T Easy vector system and afterwards incorporated into the pMAL-c2E expression vector and integrated successfully into E. coli BL21 (D3E) and TB1 strains. From these, one clone was selected and induced with IPTG 0.3 mM to express the recombinant protein lipase, obtaining a soluble fusion protein of approximately 90 kDa, consistent with the sum of the 47 kDa lipase and 43 kDa MBP which, once purified, presented lipolitic activity. Using tests in liquid medium with the p-nitrofenyl caprate substrate, it was determined that the value of Km of this enzyme is 9.75 mM. This recombinant fusion lipase was used to develop methods of directed evolution. To do so, previous work was necessary, during which the screening process was optimized, a method for activity detection in liquid medium was developed and a mutagenic technique of error-prone PCR for the lipase was adapted. The selected protocol used ТВ medium, incubation at 18 °C for 16 hours, a concentration of IPTG of 0.5 mM in a culture volume of 600 µL. The variability coefficient obtained from these conditions was 7.55 %, and it is considered suitable for the rank used in the actually. It was determined that error-prone PCR with a 7 mM magnesium and 0.05 ng/ µL DNA generated a suitable mutagenic frequency, inactivating near 50% of the clones. One round of errorprone PCR was developed with the purpose of obtaining clones with the gene encoding for the enzyme with improved activity. Finally, 400 clones were analyzed in the first cycle and 20 possible positive clones were obtained. In order to select the best clones, a new screening with only the selected clones was performed, and from these two clones were chosen. Theirs sequences were obtained and will be analyzed in the future. The best clone will be characterized and selected to be used as template in the next generation.