Comportamiento de Listeria monocytogenes en biopelículas mixtas: evaluación de la interacción del patógeno con otras especies bacterianas encontradas comúnmente en la industria alimentaria

Abstract

Listeria monocytogenes (L. monocytogenes) es una bacteria patógena transmitida por los alimentos y causante de listeriosis. Esta bacteria se multiplica bajo un amplio rango de condiciones ambientales, muchas de ellas utilizadas en la industria alimentaria para evitar la proliferación de patógenos. Entre los mecanismos de supervivencia más estudiados, se encuentra la formación de biopelículas, las cuales representan una fuente importante de contaminación de alimentos. Mientras la mayoría de las investigaciones se han enfocado en estudiar biopelículas monoespecie, existe evidencia de que en los ambientes naturales e industriales la conformación de estas biopelículas es predominantemente multiespecie (biopelículas mixtas). Esto cobra especial relevancia ya que se ha visto que al producirse interacciones inter-especies, el comportamiento de las especies que conforman las biopelículas mixtas difiere del comportamiento de las biopelículas de una sola especie, por ejemplo, en cuanto a una mejor tolerancia al estrés. El siguiente trabajo de investigación tuvo por objetivo evaluar el comportamiento de distintas cepas de L. monocytogenes al interactuar con otros microorganismos en biopelículas mixtas, utilizando especies bacterianas comúnmente encontradas en superficies de la industria alimentaria. Se evaluó la formación de biopelículas de 14 cepas de L. monocytogenes, en superficies de acero inoxidable y poliestireno mediante el método de tinción con cristal violeta (CV). A partir del análisis de estos resultados, se seleccionaron 3 cepas con alta y 3 cepas con baja capacidad formadora de biopelículas monoespecie. Paralelamente, se procesaron muestras de superficie de una planta salmonera para aislar e identificar especies bacterianas que podrían formar biopelículas junto a L. monocytogenes. Con un total de dos especies bacterianas y Staphyloccocus aureus (disponible en la colección del laboratorio), más las cepas Lmo 656-1, Lmo 186-1, List2-2, A18/75-3, A18/81-5 y A18/79-3 de L. monocytogenes, se llevaron a cabo experimentos de biopelículas mixtas, las cuales se cuantificaron mediante tinción con CV y el número de células en las biopelículas mediante recuento diferencial en placas. Por último, se evaluó la respuesta transcripcional de genes relacionados a la formación de biopelículas y respuesta a estrés específicos de L. monocytogenes cuando este patógeno se encontraba formando biopelículas con Hafnia sp., respecto a cuando formaba biopelículas sola. Los resultados indicaron que tres de las 14 cepas analizadas formaron una mayor cantidad de biopelícula en acero inoxidable comparado a poliestireno, mientras que las demás cepas tuvieron un comportamiento similar en ambas superficies. A su vez, desde las muestras de la planta salmonera se aislaron e identificaron a nivel de género las bacterias Hafnia sp. y Citrobacter sp. Al evaluar el efecto de estas especies en la cantidad de biopelícula que forman junto a L. monocytogenes, se observó que fue menor la cantidad de biopelícula total (cuantificación mediante CV) respecto a cuando L. monocytogenes formó biopelículas sola. Por el contrario, los recuentos celulares en placa indicaron un mayor número de unidades formadoras de colonia (UFC) de L. monocytogenes (P value <0,05) que formó biopelículas acompañada en comparación a su conformación monoespecie. Esta diferencia respecto a la cuantificación de biopelículas por CV y el recuento de células pudo deberse al efecto de las otras especies en la secreción de matriz extracelular que conforma la biopelícula. Finalmente, se observó una mayor abundancia relativa del transcrito del gen pflA relacionado al metabolismo de carbohidratos cuando L. monocytogenes formó biopelículas junto a Hafnia sp., respecto a cuando L. monocytogenes formó biopelículas monoespecie. Los genes agrD, lmo0644 y sigB no presentaron cambios en su respuesta transcripcional.

Listeria monocytogenes (L. monocytogees) is a foodborne pathogenic bacterium that causes listeriosis. This bacterium multiplies under a wide range of environmental conditions, many of them used in the food industry to prevent the proliferation of pathogens. Among the most studied survival mechanisms, we found the formation of biofims, wich represent an important source of food contamination. While the majority of researchs has focused on studyng monospecies biofilms, there is evidence that in natural and industrial environments the conformation of these biofilms is predominantly multispecies (mixed biofilms). This takes special relevance since it has been seen that when inter-species interactions occur, the behaviur of the species that make up mixed biofilms differs from the behaviur of biofilms of a single specie, for example, in terms of better tolerance to stress. The following research aimed to evaluate the behaviur of different strains of L. monocytogenes when interacting with other microorganism in mixed biofilms, using bacterial species commonly found on surfaces in the food industry. It was evaluated the biofilm formation of 14 strains of L. monocytogenes, on stainless steel and polystyrene surfaces by crystal violet (CV) staining method. From the analysis of these results, three high and three low monospecies biofilm-forming strains were selected. In parallel, samples from a surface of a salmon plant were processed to isolate and identify bacterial species that could form biofilms together with L. monocytogenes. With a total of 2 isolated bacterial and Staphylococcus aureus (available in the lab collection), plus Lmo 656-1, Lmo 186-1, List2-2, A18/75-3, A18/81-5 y A18/79-3 L. monocytogenes strains, mixed biofilm experiments were performed, which were quantified by the CV method and the number of cells in the biofilms by differential plate count. Finally, the transcriptional response of L. monocytogenes specific genes related to biofilm formation and stress response were evaluated when this pathogen was forming biofilms with Hafnia sp., compared to when it formed biofilms alone. The results indicated that three of the 14 strains analyzed formed a greater amount of biofilm on stainless steel compared to polystyrene, while for the other strains the behavior was similar on both surfaces. In turn, from the salmon plant samples, the bacteria Hafnia sp. and Citrobacter sp. were isolated and identified at the genus level. When evaluating the effect of these species on the amount of biofilm that they form together with L. monocytogenes, it was observed that was lower the amount of total biofilm (quantification by CV) compared to when L. monocytogenes formed biofilms alone. In contrast, plate cell counts indicated a higher number of colony forming units (CFU) of L. monocytogenes (P value <0,05) forming accompanied biofilms compared to their monospecies conformation. This difference regarding the quantification of biofilms by CV and the cell count could be due to the effect of the other species on the secretion of the extracellular matrix that makes up the biofilm. Finally, a higher relative abundance of the transcript of the pflA gene related to carbohydrate metabolism was observed when L. monocytogenes formed biofilms together with Hafnia sp., compared to when L. monocytogenes formed monospecies biofilms. The agrD, lmo0644 and sigB genes did not present changes in their transcriptional response.