Rol de CD73 en el fenotipo y la producción de citoquinas de células NK murinas expandidas in vitro

Abstract

Las células NK son linfocitos innatos que son muy relevantes en la respuesta inmune antitumoral ya que pueden reconocer y eliminar directamente las células tumorales, sin una estimulación previa. Dentro del microambiente tumoral, existe un entorno inmunosupresor, siendo la adenosina una molécula importante en este contexto, la cual señaliza principalmente a través del receptor A2A y es capaz de suprimir tanto la actividad citotóxica como la producción de citoquinas de las células NK. En el microambiente tumoral la adenosina se produce principalmente por la hidrólisis del ATP extracelular, mediante la acción de dos enzimas ectonucleotidasas CD39 y CD73. Estas enzimas son sobre expresadas en diversos tipos de cáncer y recientemente se ha demostrado que pueden expresarse en las células NK activadas, pero su función en estas células sigue siendo desconocida. Más aún, debido a que las células NK representan un porcentaje muy pequeño de las células del bazo de un ratón, es muy difícil estudiar esta población in vivo en un modelo murino. De esta forma, el objetivo de este estudio fue generar un protocolo de expansión de células NK con IL-15 de manera de evaluar el papel de CD73 en su fenotipo y funcionalidad. En concordancia con la literatura, las células NK cultivadas con IL-15 proliferaron considerablemente y regularon positivamente los marcadores clásicos de activación CD69 y CD25. Además, de los cultivos de células NK provenientes de ratones CD73KO se obtuvieron siempre más células en comparación con los del control WT. Por otro lado, tras siete días de cultivo, las células NK control y CD73KO expresaron puntos de control inmune, que son moléculas asociadas a un estado hipo-funcional denominado agotamiento. A pesar de la expresión de puntos de control inmune, las células NK mantuvieron su capacidad de producir y secretar citoquinas, así como también la producción de granzima B. Se concluye que la IL-15 permite la expansión y activación de células NK, pero un cultivo prolongado con esta citoquina podría propiciar un estado de agotamiento en estos linfocitos. Además, los datos sugieren que CD73 ejerce un rol en la regulación de la proliferación de las células NK.

NK cells are innate lymphocytes, which are key components of the antitumor immune response, as they can directly recognize and eliminate tumor cells without prior stimulation. The tumor microenvironment is highly immunosuppressive and adenosine is a pivotal molecule in this context. Adenosine signals mainly through the A2A receptor and it has been shown to suppress both cytotoxic activity and cytokine production of NK cells. This nucleoside is mainly produced by the hydrolysis of extracellular ATP through the action of CD39 and CD73 ectonucleotidases. These enzymes are overexpressed in various types of cancer and more recently in activated NK cells, but their function in these cells remains unclear. On the other hand, IL-15 stimulation is known to promote NK cell activation and proliferation both in vivo and in vitro. Thus, the aim of this study is to expand in vitro NK cells from CD73-deficient and wild type mice with IL-15 to analyze their phenotype and functionality. As expected, NK cells cultured with IL-15 proliferated considerably and positively regulated the classical activation markers CD69 and CD25. In addition, NK cell cultures from CD73KO animals always yielded more cells compared to those from the WT control. On the other hand, after seven days of culture, control and CD73KO NK cells expressed immune checkpoints, which are molecules associated with a hypo-functional state called exhaustion. Interestingly, despite the expression of immune checkpoints, NK cells maintained their ability to produce and secrete cytokines, 12 as well as granzyme B production. In conclusion, IL-15 allows the in vitro expansion and activation of NK cells, but prolonged culture with the cytokine may leads to a state of exhaustion in these lymphocytes. Finally, data presented here suggests that CD73 plays a role in regulating NK cell proliferation.