Estudio de los efectos que la actividad de la quinasa Cdk5 ejerce sobre la actividad y localización sub-celular de la GTPasa Rac1 en células neuronales embrionarias en el contexto de la neuritogénesis

Abstract

Rac1 es una pequeña proteína monomérica con actividad GTPasa que fluctúa entre una conformacion activa (unida a GTP) y una inactiva (unida a GDP). Racl-GTP se asocia directamente a proteínas que regulan la polimerizacion y la ramificacion de los filamentos de actina, modulando la actividad de estas. Tiam1 es una proteína que al unirse a Rac1 favorece su unión a GTP y la acción modulatoria sobre sus efectores. Distintas señales extracelulares confluyen en la activación localizada de Rac1 mediada por Tiam1 y, subsecuentemente, en la regulación de la dinámica del citoesqueleto de actina. Cdk5 es una proteína citoplasmática que al unirse a uno de sus cofactores proteicos p35 o p39, conforma una holo-quinasa que cataliza la fosforilaci6n de residuos Ser/Thr (SIT)PX(K/H/R), cuya actividad esta asociada a membranas. La expresion de Cdk5 es ubicua, pero su actividad esta practicamente restringida a neuronas, pues la expresion de p35 y p39 es fundamentalmente neuronal. La holo-quinasa Cdk5/p35 co-localiza con Tiam1 y Rac1 durante la extension de neuritas, elongación axonal, modelamiento dendrítico y formación de espinas dendríticas, y se han descrito diversos mecanismos en los cuales Cdk5/p35 regula la actividad de elementos reguladores de Rac1 y de sus efectores relacionados con la dinámica del citoesqueleto de actina; incluso, algunas investigaciones sugieren que Cdk5 actúa como un efector de Rac1. La comprensión de la regulación fina de la relaci6n entre Cdk5 y Rac1 requiere mayor investigación. El objetivo de este Seminario de Titulo fue determinar si la actividad quinasa de Cdk5 afecta los niveles de expresion y fosforilacion de Tiam1 y la actividad de Rac1 durante la neuritogenesis. En primer lugar, se demostro que durante la extension de neuritas en células NIE-115 tratadas con dibutiril-CAMP, molecula que induce la diferenciacion, se produce un aumento en la abundancia de Cdk5, p35 y Tiam1, y que tanto el aumento en la abundancia de Tiam1 como la extensión de neuritas se ven comprometidas si se trata simultáneamente a las células con dibutiril-CAMP y roscovitina, inhibidor farmacológico de Cdk5. A continuación, se expreso transitoriamente Tiam1 (C1199) y p35 en c6Iulas COS-7, y se determino que la activaci6n de Cdk5 a través de la expresi6n de p35 produce un gran aumento en los niveles de fosforilaci6n de Tiam1 (C1199) y un aumento leve en la actividad de Rac1. Para analizar si este mecanismo se replica duran{e la polarización in vitro de neuronas primarias hipocampales, se diseñaron mapas de FRET para comparar la activación local de Rac1 en neuronas hipocampales primarias de ratones wf y Cdk5 KO. El análisis preliminar sugiere que en las neuronas carentes de Cdk5 el nivel global de activacion de Rac1 disminuye y hay una modificacion en el patron de distribuci6n de las áreas donde Rac1 esta mss activa. Tornados en su conjunto, los resultados sugieren que Cdk5 podrida regular la actividad de Rac1 a trav6s de la fosforilaci6n, directa o mediada por otra quinasa, de Tjam1 .