Historia evolutiva de la actividad 4-amino-5-hidroximetil-2-metilpirimidina fosfato quinasa de bacterias

Abstract

Las quinasas de vitaminas son fosfotransferasas dependientes de ATP que participan en la biosíntesis de vitamina B1 y B6 fosforilando en general un grupo alcohol primario (R-OH) del sustrato. Dentro de esta familia se han descrito dos enzimas homólogas que catalizan la fosforilación de 4-amino-5-hidroxi-2-metilpirimidina (HMP) a 4-amino-5-hidroximetil-2-metilpirimidina fosfato (HMP-P) en la síntesis de vitamina B1. Una de ellas corresponde a una enzima piridoxal quinasa bifuncional codificada por el gen pdxK-tipo-HMPPK (proteína PdxK-PLK/HMPPK), que también puede catalizar la fosforilación de piridoxal a piridoxal fosfato en la síntesis de vitamina B1. La otra, corresponde a la enzima 4-amino-5-hidroxi-2-metilpirimidina fosfato quinasa codificada por el gen thiD (proteína ThiD-HMPPK), enzima que también puede catalizar la fosforilación de HMP-P a 4-amino-5-hidroximetil-2-metilpirimidina pirofosfato (HMP-PP). Esta segunda reacción de fosforilación es única en la familia de quinasas de vitaminas y en la superfamilia Riboquinasa, dado que se realiza sobre un grupo metil fosfato (R-CH2-PO4) y no sobre un alcohol primario, siendo pocos los tipos de mecanismos catalíticos descritos para la fosforilación de un grupo fosfato. Con el objetivo de determinar los factores estructurales involucrados en la fosforilación de un grupo metil fosfato en las enzimas ThiD-HMPPK y la conservación de la capacidad de fosforilar el grupo metil fosfato durante la evolución de esta familia de enzimas, se utilizó un enfoque combinado empleando cristalografía de proteínas y la reconstrucción de secuencias ancestrales. Para ello se cristalizó una enzima ThiD-HMPPK ancestral del orden Enterobacteriales (AncEnHMPPK), para la cual se conocían varias condiciones de cristalización en condición APO. Cristalizamos AncEnHMPPK en presencia de distintas combinaciones de HMP, HMP-P y análogos no hidrolizables de ATP o ADP. De los experimentos de cristalización y difracción de rayos X, se obtuvieron ocho estructuras cristalinas en complejos ternarios: 1. HMP/análogo-ATP; 2. HMP-P/análogo-ADP y 3. HMP-P/análogo-ATP. Las estructuras presentan la topología conservada de la superfamilia Riboquinasa, y sorprendentemente, no se encontraron conformaciones diferentes en elementos de estructura secundaria próximos al sitio activo al comparar complejos ternarios de HMP y HMP-P. Interesantemente, las cadenas laterales de los residuos His179 y Thr211 se acercan y se reorientan hacia los grupos fosfato de la molécula de ATP cuando se analiza el complejo ternario con HMP-P, lo cual sugeriría que esta dupla de residuos podría ser crucial y específica para la actividad HMP-P quinasa y no para la actividad HMP quinasa. Debido a que la actividad enzimática de fosforilación del grupo metil fosfato no está presentes en las enzimas homólogas PdxK-PLK/HMPPK, inferimos las relaciones filogenéticas entre las enzimas ThiD-HMPPK y PdxK-PLK/HMPPK. Del análisis evolutivo se desprende que la actividad HMPPK sería el rasgo ancestral de esta rama de la familia y que la pérdida de la actividad HMPPK en la ruta evolutiva hacia las PdxK-PLK/HMPPK sería concomitante con la aparición de la actividad PLK. Por otro lado, el análisis de la conservación de los residuos del sitio activo en las secuencias ancestrales muestra que entre el ancestro ThiD-HMPPK y el último ancestro en común con las enzimas PdxK-PLK/HMPPK (AncC) solo habría ocurrido la sustitución T211A (numeración de AncEnHMPPK). Posteriormente, el descendiente de AncC que corresponde a AncPLK/HMPPK, presenta las sustituciones Q44M, A110C y H179S, junto a una inserción de dos residuos en la horquilla β3-β4. Basándonos en este análisis evolutivo del sitio activo, las sustituciones Q44M y A110C estarían involucradas en la aparición de actividad PLK, mientras que las sustituciones T211A y H179S serian responsables de la pérdida de la actividad HMPPK en las enzimas PdxK-PLK/HMPPK. Finalmente, en este trabajo se proponen determinantes estructurales de la actividad HMPPK en las enzimas ThiD-HMPPK, mientras que el análisis evolutivo constituye un ejemplo único de evolución molecular donde una actividad enzimática emerge concomitante con la desaparición de otra actividad en una familia de enzimas.

Vitamin kinases are ATP-dependent phosphotransferases involved in vitamin B1 and B6 biosynthesis phosphorylating different substrates on a primary alcohol group (R-OH). In this family, two homologous enzymes that catalyze the phosphorylation of 4-amino-5-hydroxy-2-methylpyrimidine (HMP) to 4-amino-5-hydroxymethyl-2-methylpyrimidine phosphate (HMP-P) have been described. One of them is a bifunctional pyridoxal kinase enzyme encoded by the pdxK-like-HMPPK gene (PdxK-PLK/HMPPK), which also catalyze the phosphorylation of pyridoxal (PL) to pyridoxal phosphate (PLP, vitamin B6). The other one, corresponds to a 4-amino-5-hydroxy-2-methylpyrimidine phosphate kinase encoded by the thiD gene (ThiD-HMPPK), also able to catalyze the phosphorylation of HMP-P to 4-amino-5-hydroxymethyl-2-methylpyrimidine pyrophosphate (HMP-PP). This second phosphorylation reaction is unique in the family of vitamin kinases and in the Ribokinase superfamily, since it is performed on a methyl phosphate group (R-CH2-PO4) and not on a primary alcohol, being very few the types of catalytic mechanisms describing the phosphorylation of a phosphate group. To determine the structural factors involved in the phosphorylation of a methyl phosphate group in the ThiD-HMPPK enzymes and the conservation of the ability to phosphorylate a methyl phosphate group during the evolution of this family a combined approach of protein crystallography and ancestral sequence reconstruction was employed. For this purpose, we used an ancestral ThiD-HMPPK enzyme from Enterobacteriales order (AncEnHMPPK) for which several crystallization conditions for the APO enzyme were known. The AncEnHMPPK was crystallized in the presence of different combinations of HMP, HMP-P and non-hydrolysable ATP or ADP analogues. From the crystallization assays and X-ray diffraction experiments, eight crystal structures of the following ternary complexes were obtained: 1. HMP/ATP-analogue, 2. HMP-P/ADP-analogue and 3. HMP-P/ATP-analogue. The structures present the conserved topology for the Ribokinase superfamily, and surprisingly no different conformations in secondary structure elements close to the active site were observed when HMP and HMP-P ternary complexes were compared. Interestingly, in the ternary complex with HMP-P the side chains of residues His179 and Thr211 approach and reorient towards the phosphate groups of the ATP molecule, suggesting that this pair of residues might be crucial and specific for the HMP-P kinase activity and not for HMP kinase activity. Since the enzymatic activity of a methyl phosphate group phosphorylation is not present in the homologous PdxK-PLK/HMPPK enzymes, we inferred the phylogenetic relationships between ThiD-HMPPK and PdxK-PLK/HMPPK enzymes. The evolutionary analysis shows that the HMPPK activity would be the ancestral trait in this family branch while the loss of the HMPPK activity in the evolutionary pathway towards PdxK-PLK/HMPPK would be concomitant with the appearance of PLK activity. On the other hand, analysis of the active site residues conservation, shows that between the ancestor of ThiD-HMPPK and the last common ancestor of the PdxK-PLK/HMPPK enzymes, (AncC) only one substitution (T211A) occurs (AncEnHMPPK numbering). Subsequently, the AncC descendant corresponding to AncPLK/HMPPK, has the Q44M, A110C and H179S substitutions, along with an insertion of two residues in the β3-β4 hairpin. Based on this active site evolutionary analysis, the Q44M and A110C substitutions would be involved in the appearance of PLK activity, while the T211A and H179S substitutions would be responsible for the loss of HMPPK activity in the PdxK-PLK/HMPPK enzymes. Finally, structural determinants of HMPPK activity in ThiD-HMPPK enzymes were proposed in this work and the evolutionary analysis constitutes a unique example of molecular evolution where one enzyme activity emerges concomitant with the disappearance of another activity in an enzyme family.