Efecto de la carencia de polifosfatos y de la presencia de cobre (II) en la formación de biopelículas en Sulfolobus solfataricus

Abstract

Los polifosfatos (PoliP) son polímeros de ortofosfato inorgánico que desempeñan varias funciones en las células procariontes y eucariontes. Por ejemplo, tienen un papel protector frente al estrés oxidativo y en la resistencia a metales, pueden ser como sustituto de ATP en algunas reacciones con quinasas, entre otras. En bacterias también se han relacionado con la formación de biopelículas, movilidad y virulencia. Las biopelículas ayudan a resistir diversos tipos de estrés, como la presencia de metales, los que en algunos casos, inducen la formación de éstas. En estudios previos hemos encontrado que la presencia de Cu2+ en células de Sulfolobus solfataricus en estado plantónico, produce un aumento en los niveles de expresión de un regulador transcripcional que se ha relacionado con la formación de biopelículas. Los estudios sobre biopelículas en arqueas aún son escasos y los mecanismos que regulan el paso desde el estilo de vida plantónico al de estado sésil parecen ser diferentes a los de las bacterias. No se ha analizado el posible rol de los polifosfatos en la formación de biopelículas en este dominio de la vida. En esta tesis, analizamos el posible efecto de la ausencia de los PoliP en la formación de biopelículas y fenómenos relacionados en S. solfataricus y S. acidocaldarius y el efecto del Cu2+ en las de biopelículas de S. solfataricus. Ambos microorganismos son arqueones termoacidófilos modelo. Mediante ensayos de formación de biopelículas en placas y Microscopía Confocal Laser detectamos una reducción en la formación de biopelículas en la cepa de S. solfataricus PoliP (-) comparada con la WT. Estas células presentaron una menor movilidad, lo cual se vió reflejado en el halo de nado en placas de gelrite semisólidas. Adicionalmente, mediante tinción con DAPI de células adheridas durante 24 h a láminas de vidrio, estas mostraron una menor adherencia a esta superficie. Se generó además una cepa PoliP (-) en S. acidocaldarius, la cual se comportó de manera similar a la cepa PoliP (-) de S. solfataricus, presentando menores niveles de resistencia a Cu, poca adherencia a superficies de vidrio, menor formación de biopelícula y menor movilidad en placas semisólidas, aunque expresó el arquelo en mayor cantidad que la cepa WT. Los resultados de proteómica cuantitativa con S. solfataricus nos indicaron que existen otras diferencias a nivel metabólico. En el estado de vida plantónico se observó un aumento de las proteínas involucradas en la producción de ATP por fosforilación oxidativa, mientras que, en el estado de vida sésil se vió una preferencia por la producción de ATP a través de fosforilación a nivel de sustrato, cuando se compararon las cepas PoliP (-) versus WT. Este último comportamiento podría explicarse porque mediante la fosforilación a nivel de sustrato se genera una menor cantidad de ATP, lo que correspondería con el modo de vida en biopelícula donde la célula tendría un menor requerimiento energético. Al mismo tiempo, la generación de una menor cantidad de especies reactivas de oxígeno (ROS) por esta vía compensaría el efecto de la falta de PoliP que también interviene en la destoxificación de ROS en la célula. Sin embargo, al medir los niveles de ATP, ADP y la razón ADP/ATP, éstos se mantuvieron casi constantes en las cepas PoliP (-) y WT en estilo de vida planctónico. Al estudiar el efecto de la presencia de Cu en S. solfataricus WT, se observó un aumento en la formación de biopelículas a diferentes concentraciones del metal, llegándose a un máximo a 0,5 mM de Cu. Al comparar mediante qRTPCR y proteómica cuantitativa la respuesta a Cu de las células plantónicas versus las sésiles, se observó en el estilo de vida plantónico una mayor expresión del gen copA, relacionado a resistencia al metal, y de proteínas involucradas en la respuesta al estrés oxidativo, la cadena de transporte de electrones y aquellas del ciclo de Krebs. Estos resultados sugieren que el estado de vida sésil protegería a las células de la toxicidad de los metales pesados. Finalmente, en la cepa PoliP (-) no se pudo inducir la formación de biopelículas a 0.5 mM de Cu, probablemente porque se trata de una concentración más cercana a la CMI en estas células. Los resultados de esta tesis constituyen la primera evidencia de que los PoliP influyen en la formación de biopelículas y otros fenómenos relacionados en arqueas, específicamente en S. solfataricus y S. acidocaldarius, y de que este estilo de vida ayuda a la resistencia a Cu en S. solfataricus.

Polyphosphates (PolyP) are polymers of inorganic orthophosphate with many functions among prokaryotic and eukaryotic cells. For example, they have a protective role against oxidative stress and in heavy metal resistance. They can also act as substitute of ATP in some kinase reactions, among others. In bacteria, polyP has also been related to biofilm formation, motility and virulence. Cells living in biofilms are able to stand better diverse kinds of stresses, such as the presence of metals, which in some cases, can induce biofilm formation. Our previous preliminary studies with planktonic Sulfolobus solfataricus cells showed that the presence of Cu2+ stimulated an increase of expression levels of a transcriptional regulator related to biofilm formation. Knowledge related to biofilms in archaea are still scarce, and the mechanisms underlying the change from planktonic to sessile lifestyle seems to be different from those of bacteria. Furthermore, the possible role of PolyP in biofilm formation in archaea is unknown. In the present Thesis work, the effect of the lack of PolyP in biofilm formation and related phenomena was studied both in S. solfataricus and S. acidocaldarius, model hyperthermoacidophiles archaea. In addition, the effect of Cu2+ in S. solfataricus biofilm generation was also analyzed. By using titrate plates biofilm formation assays and confocal laser microscopy, a reduction in biofilm formation was seen in PoliP (-) S. solfataricus when compared to the WT strain. These cells lacking PolyP also showed a decreased motility, as seen by measuring the swimming ratio in semi solid gelrite plates. Additionally, PolyP (-) cells showed less glass surface adhesion after 24 h as detected by DAPI staining. A PolyP (-) S. acidocaldarius strain was also generated. Even though this strain expressed more archaelum than WT strain, it behaved similarly to S. solfataricus PolyP (-) strain, since it also showed lower Cu resistance levels, decreased adherence to glass surface and less biofilm formation and motility in semi solid plates. iTRAQ quantitative proteomic analysis of planktonic S. solfataricus PolyP (-) versus WT strains showed increased levels of proteins related to stress response and those involved in ATP generation through oxidative phosphorylation. On the other hand, sessile lifestyle cells showed a preference for ATP production via substrate-level phosphorylation, when PolyP (-) versus WT strains were compared. A possible explanation for this behaviour is that substratelevel phosphorylation generates less ATP, which would be in agreement with biofilm lifestyle. where cells would have lower energetic requirement. On the other hand, the lower levels of reactive oxygen species (ROS) generated via substrate-level phosphorylation could compensate for the effects of the lack of PolyP, which is also involved in detoxification of cells from ROS. Nevertheless, levels of ATP, ADP and the ADP/ATP ratio remained constant in PolyP (-) and WT strains in planktonic lifestyle. A raise in biofilm formation was seen in S. solfataricus WT grown at different copper concentrations, reaching a maximum quantity at 0.5 mM Cu. In addition, planktonic and sessile S. solfataricus WT cells responded to Cu by increasing their levels of copA gene expression and CopA protein levels as respectively determined by qRTPCR and quantitative proteomics. Furthermore, these microorganisms also showed a higher expression of proteins related to oxidative stress response, electronic transport chain and Krebs cycle in planktonic lifestyle. These results strongly suggest that sessile lifestyle may protect cells from heavy metal toxicity. Finally, biofilm formation could not be induced as a response to 0,5 mM Cu in S. solfataricus PolyP (-) strain most likely because this metal concentration is very close to their Copper Minimal Inhibitory Concentration. Altogether, these results show for the first time the effect of the lack of PolyP in biofilm formation, adhesion and motility in archaea, specifically S. solfataricus and S. acidocaldarius, and suggest that biofilm lifestyle is a possible Cu resistance mechanism in S. solfataricus.