Rol de la interacción de Bcl-xL con VDAC1 como mecanismo de supervivencia en etapas tempranas de senescencia celular inducida por terapia (TIS)

Abstract

La senescencia celular se ha descrito como un fenotipo caracterizado por un arresto permanente e irreversible del ciclo celular, además de un fenotipo secretorio asociado a senescencia (SASP). Por otro lado, presenta daño macromolecular y alteraciones metabólicas, que incluyen una acumulación de calcio (Ca2+) mitocondrial. Pese a esto último, una característica relevante del fenotipo es que presenta una resistencia a la apoptosis mediada por la vía intrínseca. Esta resistencia está mediada por proteínas antiapoptóticas de la familia Bcl-2, como por ejemplo la proteína asociada a linfoma de células-B extralargo (Bcl-xL), la cual aumenta en células senescentes inducidas luego de una exposición a tratamientos anticancerígenos. Este fenómeno se conoce como senescencia celular inducida por terapia (TIS). Por otra parte, se ha caracterizado que la inhibición de Bcl-xL genera senolisis (muerte selectiva de células senescentes), específicamente por fármacos tales como Navitoclax (ABT-263), mimético del dominio BH3. Investigaciones en células cancerígenas muestran que Bcl-xL interactúa con el canal aniónico dependiente de voltaje 1 (VDAC1), evitando una sobrecarga de Ca2+ mitocondrial al disminuir la captación de Ca2+ en la mitocondria mediada por VDAC1, y de esta forma impide la apoptosis. Actualmente se desconoce si este mecanismo de supervivencia ocurre en etapas tempranas de TIS permitiendo el desarrollo del fenotipo senescente. Por lo cual se propuso la siguiente hipótesis: “La interacción entre Bcl-xL y VDAC1 en etapas tempranas de TIS inducida por doxorrubicina en células IMR90 genera una disminución en la captación de Ca2+ mitocondrial, permitiendo la supervivencia de las células y el establecimiento del fenotipo senescente”. Al establecer un tratamiento temprano de 24 h con doxorrubicina como inductor de TIS en células IMR90, encontramos que: incrementan los niveles de la proteína Bcl-xL, su colocalización con la mitocondria, así como también su proximidad con VDAC1. Además, se observa una disminución en la captación de Ca2+ en la mitocondria proveniente desde el retículo endoplásmico (RE). Al realizar nuevamente el tratamiento temprano de TIS en células IMR90, pero añadiendo en conjunto ABT-263, descrito como inhibidor de las proteínas Bcl-xL, Bcl-w y Bcl-2; ocurre una reversión de los efectos descritos. Destacándose un incremento en la captación de Ca2+ en la mitocondria, concomitante con una disminución en la viabilidad celular. Los datos obtenidos fueron un indicio de que ABT-263, al actuar como inhibidor de Bcl-xL, podría interrumpir la interacción entre Bcl-xL y VDAC1. Esto fue probado mediante docking molecular de estas proteínas, teniendo en cuenta que la literatura previa indica que la interacción entre las proteínas de interés estaría mediada por el dominio BH4, mientras que ABT-263 es un mimético del dominio BH3. Finalmente, en el modelo propuesto de docking se encontró que ABT-263 estaría posicionándose en sitios aledaños caracterizados como clave en la interacción de Bcl-xL y VDAC1, describiéndose que Bcl-xL es capaz de interaccionar con VDAC1 mediante los aminoácidos TYR101, ASN136, ARG139, LEU194 y TYR195. En resumen, esta investigación nos permitió dilucidar la relevancia en la interacción de Bcl-xL con VDAC1 como mecanismo de supervivencia que se establece en etapas tempranas de TIS en células normales, lo que conlleva al posterior desarrollo del fenotipo senescente inducido por doxorrubicina. Además, se logró describir el efecto senolítico de ABT-263, de manera tanto funcional como estructural.

Cellular senescence has been identified as a phenotype characterized by permanent and irreversible cease to divide, as well as by a secretory senescence-associated pro-inflammatory phenotype (SASP) and resistance to apoptosis. On the other hand, it presents macromolecular damage and metabolic alterations, which include an accumulation of mitochondrial calcium (Ca2+). Despite of the later, a relevant characteristic of this phenotype is it presents apoptosis resistance mediate by intrinsic pathway. This resistance is mediated by antiapoptotic proteins belonging to the Bcl-2 family, like protein B-cell lymphoma-extra-large (Bcl-xL), which increase in senescence cells induced after exposure to anticancer treatments. This phenomenon is known as therapy-induced senescence (TIS). On the other hand, it has been characterized that Bcl-xL inhibition generates senolysis (selective senescent cell death), specifically by drugs such as Navitoclax (ABT-263), mimetic of the BH3 domain. Studies in cancer cells shows that the interaction between Bcl-xL and Voltage Dependent Anion Channel 1 (VDAC1), avoids mitochondrial Ca2+ overload by decreasing VDAC1-mediated Ca2+ uptake into the mitochondria, and thus prevents apoptosis. Currently, it remains unknown whether this survival mechanism would be shared between cancer cells and early stages of normal TIS cells, which may allow the development of the senescent phenotype. Therefore, the following hypothesis was proposed: “The interaction between Bcl-xL and VDAC1 in early stages of TIS induced by doxorubicin in IMR90 cells generates a decrease in mitochondrial Ca2+ uptake, allowing cell survival and the establishment of senescent phenotype.” Establishing an early 24-h treatment with doxorubicin as an inducer of TIS in IMR90 cells, we found that: levels of the Bcl-xL protein, its colocalization with mitochondria, as well as its proximity to VDAC1 increase. In addition, a decrease in the uptake of Ca2+ in the mitochondria from the endoplasmic reticulum (ER) is observed. By carrying out the early treatment of TIS again in IMR90 cells, but adding together ABT-263, a mimetic of the BH3 domain described as an inhibitor of the Bcl-xL, Bcl-w and Bcl-2 proteins; a reversal of the effects described occurs. Standing out an increase in the uptake of Ca2+ in the mitochondria, concomitant with a decrease in cell viability. The data obtained were indicative that ABT-263, by acting as an inhibitor of Bcl-xL, could disrupt the interaction between Bcl-xL and VDAC1.This was tested by molecular docking of these proteins, considering that previous literature indicates that the interaction between the proteins of interest would be mediated by BH4 domain, whereas ABT-263 is a mimetic of the BH3 domain. Finally, in the proposed docking model it was found that ABT-263 would be positioning itself in neighboring sites characterized as key in the interaction of Bcl-xL and VDAC1, describing that Bcl-xL can interact with VDAC1 through the amino acids TYR101, ASN136, ARG139, LEU194, and TYR195. In summary, this study aims to dilucidate the relevance of the interaction between Bcl-xL and VDAC1 as a survival mechanism that establish in early stage of TIS in normal cells, that leads to development to the senescent phenotype. Also, it was possible to describe the senolytic effect of ABT-263, both functionally and structurally.