Purificación y caracterización de una lipasa recombinante de un microorganismo termofílico antártico y determinación de su estabilidad en solventes orgánicos

Abstract

Las lipasas son enzimas que catalizan la hidrólisis de ésteres carboxílicos de cadena larga, que en presencia de solventes orgánicos pueden biocatalizar reacciones de síntesis orgánica. Sin embargo, el uso de solventes orgánicos en estos procesos produce la desnaturalización de la enzima, disminuyendo su actividad enzimática. Debido a esto, es de gran interés disponer de nuevas lipasas resistentes a condiciones denaturantes, siendo buenas candidatas las enzimas de organismos termófilos. Estas enzimas se han adaptado evolutivamente a mantener su actividad a altas temperaturas y se ha reportado que estas mismas adaptaciones le pueden conferir una alta estabilidad frente a agentes caotrópicos, solventes orgánicos y alta salinidad. Lip7 es una lipasa proveniente de Geobacillus sp. ID17, un microorganismo termofílico aislado en Isla Decepción, Antártica, que fue expresada de forma recombinante en E. coli C41 (DE3). La purificación de Lip7 se logró con un rendimiento del 23 % y 4,3 veces de purificación. Su caracterización enzimática indicó que es una enzima termo-alcalina con una velocidad máxima de 2.565 U/mg a 50°C y pH 11,0 para el sustrato p-nitrofenol laurato. Su cinética no siguió un comportamiento de Michaelis-Menten. Esta enzima mostró un comportamiento sigmoidal con parámetros de K1/2 y kcat de 0,97 mM y 1838 s-1, respectivamente. Respecto a su estabilidad térmica, Lip7 es estable entre 40-60°C a pH 8 y entre 40-50°C a pH 11,0. Además, la apoproteína de Lip7 es estable en solventes orgánicos y en determinadas condiciones sufre una activación enzimática posterior a la incubación en metanol y etanol. Lip 7 sería una de las primeras lipasas de la subfamilia I.5, nativa del género Geobacillus aislada y purificada con actividad y estabilidad a pH 11,0. Además, al ser estable en solventes orgánicos, puede ser una candidata interesante en futuras investigaciones de biocatálisis.

Lipases are enzymes that catalyse the hydrolysis of long-chain carboxylic esters, and in the presence of organic solvents, they can catalyse organic synthesis reactions. However, the use of organic solvents in these processes leads to enzyme denaturation, reducing their enzymatic activity. Therefore, there is a significant scientific interest to find new lipases that are resistant to denaturing conditions. and enzymes from thermophiles emerge as promising candidates for this purpose. These enzymes have undergone evolutionary adaptations to sustain their enzymatic activity under high-temperature conditions, and it has been reported that these same adaptations can confer high stability against chaotropic agents, organic solvents, and high salinity. Lip7 is a lipase from Geobacillus sp. ID17, a thermophilic microorganism isolated from Deception Island, Antarctica, which was expressed recombinantly in E. coli C41 (DE3). The purification of Lip7 was achieved with a 23 % yield and 4.3-fold purification. Its enzymatic characterization indicated that it is a thermo-alkaline enzyme with a maximum rate of 2,565 U/mg at 50°C and pH 11.0 for the substrate p-nitrophenol laurate. Moreover, its kinetics did not follow Michaelis-Menten, having a sigmoidal behaviour with K1/2 and kcat parameters of 0.97 mM and 1838 s-1, respectively. Regarding its thermal stability, it was found stable between 40-60°C at pH 8.0 and between 40-50°C at pH 11.0. Finally, Lip7 was not only stable in organic solvents, but under certain conditions undergoes enzymatic activation following incubation in methanol and ethanol. Lip7 would be one of the first lipases of the I.5 family and from the genus Geobacillus isolated and purified with activity and stability at pH 11.0. Moreover, being stable in organic solvents, makes this enzyme an interesting candidate for future biocatalysis research and biotechnological applications.