Estructuras tipo minicélulas como mecanismo de expulsión de Quantum Dots y tolerancia a metales en Escherichia coli

Abstract

Antecedentes: Los quantum dots (QDs) son nanopartículas fluorescentes, cuyas cualidades ópticas las hacen de interés en múltiples áreas. Una forma para su obtención es por medio de biosíntesis bacteriana, donde distintas especies fabrican las nanopartículas al ser cultivadas en presencia de sales metálicas. Sin embargo, el mecanismo de síntesis es poco conocido a la fecha. Estudios en Escherichia coli sugieren que los QDs biosintetizados se asocian al polo celular, y a subsecuentes eventos de división polar para su eliminación. Este comportamiento se asemeja a un fenómeno descrito recientemente en E. coli que comprende la relocalización de cuerpos de inclusión en los polos de la célula para su eliminación dentro de minicélulas. Considerando que la exposición a metales usados comúnmente en la biosíntesis de QDs (cadmio o teluro) también genera cuerpos de inclusión, es posible pensar que durante el proceso de biosíntesis la célula genera minicélulas como un mecanismo de expulsión del metal. A su vez, la producción de minicélulas entregaría una mayor tolerancia a los metales pesados ya que permitiría su eliminación de la célula. No obstante, a la fecha no se ha estudiado si existe relación entre la producción de minicélulas y la exposición a metales pesados en E. coli. Hipótesis: La biosíntesis de QDs de cadmio en E. coli induce la generación de minicélulas como una respuesta para la expulsión del metal de la célula. Métodos: Se realizó biosíntesis intracelular de QDs en la cepa E. coli AG1/pCA24NgshA, modelo descrito de biosíntesis de QDs y formación de estructuras similares a minicélulas. La morfología celular y distribución de QDs se analizó por microscopía de fluorescencia y microscopía electrónica de transmisión (TEM). La presencia de cuerpos de inclusión fue evaluada por TEM y SDS-PAGE. Para analizar cómo la producción de minicélulas puede afectar la biosíntesis de QDs, se realizó biosíntesis intracelular de QDs de cadmio en cepas mutantes del sistema Min (ΔminC; ΔminCDE) productoras de minicélulas. Se analizó la tolerancia a cadmio por difusión en placa y cuantificación de MIC. La morfología celular y distribución de QDs se evaluó por microscopía de fluorescencia y TEM. Resultados: En el modelo de E. coli AG1/pCA24NgshA, los QDs se acumulan principalmente en los polos de las células. Además, se pueden distribuir en células esféricas, de tamaño menor a 1 μm, las que podrían corresponder a minicélulas. En condiciones de biosíntesis, el número de células de tamaño menor a 1 μm aumenta a un ~5%, en comparación al control de ~1%. Además, los QDs colocalizan con cuerpos de inclusión generados en la célula. Al estudiar cepas productoras de minicélulas, se determinó que estas son menos tolerantes a cadmio que la cepa WT. No obstante, al realizar biosíntesis, los QDs se ubican a lo largo de la célula, con una alta densidad dentro de las minicélulas generadas. Además, la biosíntesis en las cepas productoras de minicélulas genera QDs con mayor intensidad de fluorescencia que la cepa WT. Finalmente, se determinó que las minicélulas cargadas con QDs presentan mayor intensidad de fluorescencia por área en comparación a células bacilares, lo que sugiere que los QDs se acumulan preferentemente en minicélulas. Conclusiones: La biosíntesis intracelular de QDs de cadmio en E. coli se relaciona a la producción de minicélulas que se generan por división polar y encapsulan a las nanopartículas. Las cepas productoras de minicélulas acumulan QDs principalmente dentro de minicélulas para su expulsión. Este trabajo es el primero en reportar la relación entre la formación de minicélulas y la biosíntesis de QDs, dando luces en la importancia fisiológica de ambos procesos. Además, recalca la oportunidad para el estudio de la generación de minicélulas cargadas con nanopartículas de interés de alta calidad y con alta emisión de fluorescencia para distintas aplicaciones.

Background: Quantum dots (QDs) are fluorescent nanoparticles, whose optical properties make them of interest in multiple areas. A way to generate them is through bacterial biosynthesis, where different species manufacture nanoparticles when cultivated in the presence of metallic salts. However, the mechanism of synthesis is poorly understood to date. Studies in Escherichia coli suggest that biosynthesized QDs associate to the cell pole and to subsequent polar division events for their removal. This behaviour resembles a recently described phenomenon in E. coli involving the relocation of inclusion bodies to the poles of the cell for their elimination within minicells. Considering that exposure to metals commonly used in the biosynthesis of QDs (cadmium or tellurium) also generates inclusion bodies, it is possible to think that during the biosynthesis process, the cell generates minicells as a metal expulsion mechanism. In turn, the production of minicells would provide a greater tolerance to heavy metals since it would allow their elimination from the cell. However, to date it has not been studied whether there is a relationship between minicell production and exposure to heavy metals in E. coli. Hypothesis: The biosynthesis of cadmium QDs in E. coli induces the generation of minicells as a response for the removal of the metal from the cell. Methods: Intracellular biosynthesis of QDs was performed in the strain E. coli AG1/pCA24NgshA, a described model of QDs biosynthesis and formation of minicell-like structures. Cell morphology and distribution of QDs was analysed by fluorescence microscopy and transmission electron microscopy (TEM). The presence of inclusion bodies was evaluated by TEM and SDS-PAGE. To analyse how minicell production may affect QDs biosynthesis, intracellular biosynthesis of cadmium QDs was performed in minicell-producing Min system mutant strains (ΔminC; ΔminCDE). Cadmium tolerance was analysed by plate diffusion and MIC quantification. Cell morphology and distribution of QDs was assessed by fluorescence microscopy and TEM. Results: In the E. coli AG1/pCA24NgshA model, QDs accumulate mainly at the poles of cells. In addition, they can be distributed in spherical cells, smaller than 1 μm in size, which could correspond to minicells. Under biosynthesis conditions, the number of cells smaller than 1 μm is increased to ~5%, compared to ~1% in control condition. Furthermore, the QDs colocalize with inclusion bodies generated in the cell. When studying strains that produce minicells, it was determined that they are less tolerant to cadmium than the WT strain. However, when performing biosynthesis, the QDs are located throughout the cell, with a high density within the generated minicells. In addition, biosynthesis in minicell-producing strains generates QDs with higher fluorescence intensity than the control strain. Finally, it was determined that minicells loaded with QDs present higher fluorescence intensity per area compared to rod cells, suggesting that QDs accumulate preferentially in minicells. Conclusions: The intracellular biosynthesis of cadmium QDs in E. coli is related to the production of minicells that are generated by polar division and encapsulate the nanoparticles. Minicell-producing strains accumulate QDs primarily within minicells for expulsion. This work is the first to report the relationship between minicell formation and QDs biosynthesis, shedding light on the physiological importance of both processes. In addition, it highlights the opportunity to study the generation of minicells loaded with high-quality nanoparticles of interest with high fluorescence emission for different applications.