Identificación de nuevas enzimas extracelulares involucradas en la actividad entomopatógena de Beauveria pseudobassiana RGM 2184 sobre Lobesia botrana

Abstract

La polilla de la vid, Lobesia botrana, es una plaga cuarentenaria que afecta la exportación de uva de mesa nacional. Este insecto se encuentra en estado de pupa, cubierto de un denso capullo durante la época de otoño-invierno. Actualmente, no existen métodos de control comercial para L. botrana durante este periodo. Sin embargo, el hongo entomopatógeno (HEP) Beauveria pseudobassiana RGM 2184 demostró un nivel máximo de eficacia del 80% contra esta plaga en ensayos de campo realizados en dos regiones de Chile, durante dos temporadas de otoño-invierno. Se ha descrito que la acción biocontroladora de los HEPs está dada por la secreción de enzimas hidrolíticas (lipasas/proteasas/quitinasas) que degradan los distintos componentes de la cutícula del artrópodo. En base a estos antecedentes, se postula la siguiente hipótesis: El hongo entomopatógeno Beauveria pseudobassiana RGM 2184 secreta enzimas hidrolíticas adaptadas al frío, capaces de degradar la seda del capullo y la cutícula de la pupa de Lobesia botrana. Para abordar esta hipótesis se realizó una predicción de exoenzimas con actividad lipolítica/quitinolítica/proteolítica en el genoma de la cepa RGM 2184, por el cual se detectaron 45 proteasas, 11 lipasas y 3 quitinasas. Se cultivó el HEP en medios líquidos para inducir la secreción de proteasas, lipasas y quitinasas. Por medio de una precipitación por acetona, se obtuvieron los extractos proteicos del sobrenadante del cultivo de RGM 2184 en cada uno de los medios de cultivo. Mediante zimografía se logró visualizar tres proteasas y una lipasa, que presentaron masas moleculares de 32, 105, 133 y 52 kDa, respectivamente. Los extractos proteicos fueron analizados por medio de espectrometría de masas logrando identificar 2 proteasas (P1 y P2), 2 lipasas (Lip1 y Lip2) y 3 quitinasas (Chi1, Chi2 y Chi3). A través de ensayos de actividad enzimática realizados a distintos pHs y temperaturas, se evaluó la actividad de los extractos proteicos. En el caso de las proteasas, la mayor actividad se registró a pH 7 y a 50°C. Por otro lado, la actividad lipolítica registró dos picos de actividad, a pH ácido (pH 2) y a pH básico (pH 8). En el caso de pH ácido, la mayor actividad se registró a 25°C. Mientras que a pH 8 se visualizaron dos picos, a 10 y 25°C. La actividad quitinolítica presentó mayor actividad a pHs ácidos (entre 2 y 5). Las quitinasas del extracto presentaron en conjunto mayor actividad a 45°C. Adicionalmente, la exposición de pupas y seda a los extractos proteicos obtenidos tanto a 10 como a 25°C, evidenciaron daños estructurales debido a la acción de enzimas extracelulares de la cepa RGM 2184. En base a estos resultados se concluye que la cepa B. pseudobassiana RGM 2184 secreta una batería enzimática que presenta actividad catalítica en un amplio rango de temperaturas y pHs. Estas enzimas son capaces de degradar matrices complejas de tejidos de insectos a bajas temperaturas, otorgándole al HEP una ventaja competitiva sobre otras estrategias de control, como los insecticidas químicos, que no pueden penetrar en el capullo de insectos.

The grapevine moth, Lobesia botrana, is a quarantine pest that affects domestic table grape exports. This insect is in the pupal stage, covered with a dense cocoon during the autumn-winter season. Currently, there are no commercial control methods for L. botrana for this period. However, the entomopathogenic fungus (HEP) Beauveria pseudobassiana RGM 2184 demonstrated a maximum efficacy level of 80% against this pest in field trials conducted in two regions of Chile, during two autumn-winter seasons. It has been described that the biocontrol action of HEPs is due to the secretion of hydrolytic enzymes (lipases/proteases/chitinases) that degrade the different components of the arthropod cuticle. Based on this background, it is postulated that the entomopathogenic fungus B. pseudobassiana RGM 2184 secretes cold-adapted hydrolytic enzymes capable of degrading the cocoon and cuticle silk of the moth L. botrana. To address this hypothesis, a prediction of exoenzymes with lipolytic/chitinolytic/proteolytic activity was performed on the genome of strain RGM 2184, whereby 45 proteases, 11 lipases and 3 chitinases were detected. HEP was cultured in liquid media to induce secretion of proteases, lipases and chitinases. By acetone precipitation, protein extracts were obtained from the supernatant of the RGM 2184 culture in each of the culture media. By zymography, three proteases and one lipase were visualized with molecular masses of 32, 105, 133 and 52 kDa, respectively. The protein extracts were analyzed by mass spectrometry, identifying 2 proteases (P1 and P2), 2 lipases (Lip1 and Lip2) and 3 chitinases (Chi1, Chi2 and Chi3). The activity of the protein extracts was evaluated by means of enzyme activity assays performed at different pHs and temperatures. In the case of proteases, the highest activity was recorded at pH 7 and at 50°C. On the other hand, lipolytic activity registered two peaks of activity, at acidic pH (pH 2) and at basic pH (pH 8). In the case of acid pH, the highest activity was recorded at 25°C. While at pH 8, two peaks were visualized, at 10 and 25°C. The chitinolytic activity presented higher activity at acidic pHs (between 2 and 5). The chitinases of the extract showed overall higher activity at 45°C. Additionally, the exposure of pupae and silk to the protein extracts obtained at 10 and 25°C showed structural damage due to the action of extracellular enzymes of strain RGM 2184. Based on these results, it is concluded that strain B. pseudobassiana RGM 2184 secretes an enzyme battery that exhibits catalytic activity over a wide range of temperatures and pHs. These enzymes can degrade complex insect tissue matrices at low temperatures, giving HEP a competitive advantage over other control strategies, such as chemical insecticides, which cannot penetrate the insect cocoon.