Diseño y caracterización de nanoemulsiones que contienen un extracto rico en procianidinas proveniente de cáscara de palta : evaluación en células de melanoma

Abstract

Diversos estudios han demostrado una gran variedad de efectos biológicos beneficiosos en procesos de inflamación, oxidación y cáncer atribuidos a los polifenoles, como las procianidinas. Sin embargo, estos compuestos lipofílicos están limitados por una baja solubilidad y alta inestabilidad a distintas condiciones. La cáscara de palta se presenta como una potencial fuente de procianidinas y, debido a que es considerada como material de desecho, la obtención y uso de un extracto rico en procianidinas (Ext) contribuiría a la economía circular y añadiría valor agregado a este producto. Por otro lado, la nanoemulsificación representa una estrategia clave para aprovechar los beneficios de los compuestos lipofílicos, manteniendo su estabilidad. En la presente investigación se propone la siguiente hipótesis: Es posible encapsular un extracto rico en procianidinas en nanoemulsiones tipo O/W, las que presentan efectos citotóxicos, disminuyen la proliferación y migración celular y reducen la activación de Akt Thr308 en células de melanoma B16F10 in vitro, en comparación con el efecto del extracto libre. Los objetivos específicos que se plantean para responder esta hipótesis son: 1.- Diseñar y desarrollar nanoemulsiones O/W que contengan el extracto rico en procianidinas. 2.- Caracterizar las nanoemulsiones O/W conteniendo el extracto rico en procianidinas. 3.- Determinar el efecto de las formulaciones en la viabilidad y morfología de células de melanoma B16F10 y de riñón embrionario HEK293. 4.- Evaluar el efecto de las formulaciones en el ciclo celular y proliferación de células de melanoma B16F10. 5.- Determinar el efecto de las formulaciones en la migración de células de melanoma B16F10. 6.- Evaluar la internalización de la formulación en células de melanoma B16F10. 7.- Determinar el efecto de las formulaciones en la activación de Akt y ERK 1/2 en células de melanoma B16F10. En base a lo planteado, se reporta el desarrollo, caracterización y evaluación de una nanoemulsión cargada con un extracto rico en procianidinas (Nem-Ext) proveniente de cáscara de palta. El método para producir las nanoemulsiones fue amigable con el medioambiente y se utilizaron productos biocompatibles. Se elaboraron partículas esferoidales de ≈160 nm, con baja polidispersión (PDI ≤ 0.1), potencial zeta negativo (≈−50 mV), alta eficiencia de encapsulación de procianidinas (≈97%), alta carga de extracto (≈13%), y con una alta concentración de las nanoestructuras (≈4.7 x 1012 partículas/mL). Nem-Ext fue estable en términos de tamaño y potencial zeta a distintas concentraciones de sal (hasta 120 mM de NaCl), gradiente de pH (rango de 4−10), tiempo de almacenamiento (hasta 90 días) y temperatura (hasta 50 °C). Se destaca que las Nem-Ext puede ser convertidas en un polvo seco reconstituible en medio acuoso, luego de un proceso de liofilización. Los ensayos celulares demostraron que Nem-Ext reduce significativamente la viabilidad de las células de melanoma in vitro (B16F10; ensayo de reducción de MTT), comparado con Ext. Estos resultados no se observaron en las células no cancerígenas (HEK293), por el contrario, se evidenció un efecto protector de la viabilidad celular. Adicionalmente, se demostró que la nanoformulación puede inhibir la migración de las células de melanoma de manera in vitro (ensayo de herida y cámaras Transwell). Nem-Ext no causó un cambio significativo en el estadío del desarrollo celular al evaluar el ciclo celular (FACs), pero disminuyó el número de células marcadas con Ki67, un indicador de proliferación. Sumado a lo anterior, se comprobó in vitro que la internalización celular del contenido de las nanoemulsiones se realiza a través de endocitosis (microscopía de fluorescencia). Finalmente, se demostró que la encapsulación de Ext causa una disminución significativa de la activación de Akt en Thr308, una proteína clave en la vía de señalización PI3K/Akt que promueve la progresión del cáncer. En conjunto, la evaluación celular in vitro de la encapsulación de un extracto rico en procianidinas en nanoemulsiones sugiere que la formulación es simple, segura y eficaz para aumentar la actividad anticancerígena, por lo que se presenta como potencial candidata para la prevención/tratamiento del melanoma (y potencialmente otros tipos de cáncer).

Several studies have shown a wide variety of beneficial biological effects on inflammation, oxidation and cancer processes attributed to polyphenols, such as procyanidins. However, these lipophilic compounds are limited by low solubility and high instability under different conditions. Avocado peel is a potential source of procyanidins and because it is considered as waste material, obtaining, and using an extract rich in procyanidins (Ext) would contribute to the circular economy and add value to this product. On the other hand, nanoemulsification represents a key strategy to take advantage of the benefits of lipophilic compounds, maintaining their stability. In the present research the following hypothesis is proposed: It is possible to encapsulate a procyanidin-rich extract into O/W nanoemulsions, which exhibit cytotoxic effects, decrease cell proliferation and migration, and reduce the activation of Akt Thr308 in B16F10 melanoma cells in vitro, compared to the effect of the free extract. The specific objectives that arise to answer this hypothesis are: 1.- Design and develop O/W nanoemulsions containing procyanidin-rich extract. 2.- Characterize O/W nanoemulsions containing extract rich in procyanidins. 3.- To determine the effect of formulations on the viability and cell morphology of melanoma B16F10 cells and embryonic kidney HEK293. 4.- To evaluate the effect of formulations on the cell cycle and proliferation of melanoma B16F10 cells. 5.- To determine the effect of formulations on the migration of B16F10 melanoma cells. 6.- Evaluate the internalization of the formulation in B16F10 melanoma cells. 7.- To determine the effect of formulations on the activation of Akt and ERK 1/2 in melanoma B16F10 cells. Based on the above, the development, characterization, and evaluation of a nanoemulsion loaded with a procyanidins-rich extract (Nem-Ext) from avocado shell is reported. The method to produce the nanoemulsions was environmentally friendly and biocompatible products were used. Spheroidal particles of ≈160 nm, with low polydispersion (PDI ≤ 0.1), negative zeta potential (≈−50 mV), high efficiency of encapsulation of procyanidins (≈97%), high drug load (≈13%), and with a high concentration of nanostructures (≈4.7 x 1012 particles / mL) were elaborated. Nem-Ext was stable in terms of size and zeta potential at different salt concentrations (up to 120 mM NaCl), pH gradient (range 4−10), storage time (up to 90 days) and temperature (up to 50 °C). It is emphasized that Nem-Ext can be converted into a dry powder reconstitutable in aqueous medium, after a lyophilization process. Cell assays demonstrated that Nem-Ext significantly reduces the viability of melanoma cells in vitro (B16F10; MTT reduction assay), compared to Ext. These results were not observed in non-cancer cells (HEK293), on the contrary, a protective effect was evidenced. Additionally, it was shown that the nanoformulation can inhibit the migration of melanoma cells in vitro (wound assay and Transwell chambers). Nem-Ext did not cause a significant change in the stage of cell development when cell cycle was evaluated (FACs), but decreased the number of cells labeled with Ki67, an indicator of proliferation. In addition to the above, it was found that the cellular internalization of the content of the nanoemulsions in vitro is carried out through endocytosis (fluorescence microscopy). Finally, Ext encapsulation was shown to cause a significant decrease in Akt activation in Thr308, a key protein in the PI3K/Akt signaling pathway that promotes cancer progression. Overall, in vitro cellular evaluation of procyanidin-rich extract encapsulation in nanoemulsions suggests that the formulation is simple, safe, and effective in increasing anticancer activity, and is therefore presented as a potential candidate for the prevention/treatment of melanoma (and potentially other cancers).