Rol de las proteínas celulares PTB1, Nucleolina y hnRNPU en el inicio de la traducción de mRNAs retrovirales mediado por IRESs

Abstract

Los RNA genómicos (gRNAs) de HIV-1, HTLV-1 y MMTV que codifican para las proteínas estructurales Gag y Gag-pol, pueden iniciar su traducción utilizando un mecanismo dependiente de la estructura 5´cap (m7GpppN) o bien mediante el uso de sitios de entrada interna del ribosoma (IRES). Los gRNAs de HIV-1, HTLV-1 y MMTV poseen un IRES en su región 5´UTR. Se ha propuesto que cuando la traducción cap-dependiente es inhibida, por ejemplo, durante la progresión del ciclo replicativo viral, el inicio de la traducción cambia de cap-dependiente a un mecanismo IRES-dependiente. Esta estrategia permitiría asegurar la síntesis de la proteína estructural Gag durante todo el ciclo replicativo. En la actualidad aún se desconocen los mecanismos moleculares por los cuales los elementos IRES reclutan la maquinaria traduccional, no obstante, se ha sugerido que la actividad del elemento IRES depende del contexto celular y requiere de la participación de proteínas celulares denominadas factores trans-activadores de IRES (ITAF) que actúan modulando el inicio de la traducción. Estudios comparativos de los IRESs retrovirales de HIV-1, HTLV-1 y MMTV han establecido que su actividad y mecanismo de reclutamiento de la maquinaria traduccional varía según el contexto celular en el que se encuentren. Más aún, diversos estudios sugieren que el reconocimiento del gRNA de HIV 1 por parte de la maquinaria traduccional requiere un paso del RNA por el núcleo celular. Desde un punto de vista biológico este fenómeno se puede contextualizar al considerar que a diferencia de otros virus de RNA que poseen IRESs como sería el caso de los picornavirus cuyo ciclo replicativo está confinado al citoplasma de la célula, los retrovirus realizan un ciclo replicativo que transcurre entre el núcleo y citoplasma de la célula, siendo el núcleo el lugar de síntesis de los gRNAs. De esta forma, durante la síntesis de los gRNAs retrovirales diversas proteínas celulares interactuarían, de forma directa o indirecta, con el gRNA formando al menos un complejo ribonucleoproteíco (RNP) el cual participaría en la etapa de exporte del gRNA viral y podría posteriormente regular la asociación del gRNA viral con la maquinaria traduccional. Considerando esta posibilidad, el objetivo de este trabajo fue identificar al menos una proteína celular que forme parte del complejo-RNP y que participe en la regulación de la traducción IRES-dependiente del gRNA de HIV-1, HTLV-1 y MMTV. A través de un análisis in silico, se determinó que la región 5´UTR de MMTV posee sitios putativos de unión para la proteína PTB1. Posteriormente y a través de ensayos funcionales determinamos que la proteína PTB1 se une in vitro e in vivo a la región 5´UTR y actúa como un factor trans-activador del elemento IRES de MMTV. En la búsqueda de nuevos ITAFs para los elementos IRES retrovirales, ensayos realizados por cromatografía de afinidad (GRNA) acoplado a espectrometría de masas nos permitieron identificar distintas proteínas celulares asociadas a las regiones 5´UTR de HIV-1 y HTLV-1 entre las cuales se encontraban las proteínas nucleolina y hnRNPU. Los resultados obtenidos para nucleolina indican que el silenciamiento en la expresión génica de la proteína no tiene un efecto sobre la traducción, mientras que una sobreexpresión de la proteína sólo incrementa la actividad del elemento IRES de HTLV-1. Por otra parte, los resultados obtenidos con hnRNPU nos permitieron determinar que la proteína se une a la región 5´UTR de HIV-1 y HTLV-1 y actúa como un factor trans-activador para el inicio de la traducción IRES-dependiente de los tres IRES retrovirales en estudio. Los resultados obtenidos en este trabajo nos permitieron por lo tanto identificar nuevos ITAFs celulares que participan en el inicio de la traducción IRES-dependiente de HIV-1, HTLV-1 y MMTV

The genomics RNA (gRNAs) of HIV-1, HTLV-1 and MMTV coding for the Gag and Gag-pol structural proteins, can start their translation process using a mechanism dependent on the 5'cap structure (m7GpppN) or through the use of internal ribosome entry sites (IRES). The gRNAs of HIV-1, HTLV-1 and MMTV have an IRES element in their 5´UTR region and it has been proposed that when the cap-dependent translation initiation is inhibited, for example, during the progression of the viral replicative cycle, the translation initiation changes from cap -dependent on an IRES-dependent mechanism. This strategy would allow to ensure the synthesis of the Gag structural protein throughout the replicative cycle. At present times, the molecular mechanisms that allow the IRESs to recruit the translational machinery are still unknown, however, it has been suggested that the activity of the IRES element depends on the cellular background and requires the participation of cellular proteins called IRES trans-acting factors (ITAF) that can act by modulating the IRES dependent translation initiation. Comparative studies of the retroviral IRESs of HIV 1, HTLV-1 and MMTV have established that their activity and mechanism of recruitment of the translational machinery varies according to the cellular context in which they are located. Moreover, several studies suggest that recognition of HIV-1 gRNA by the translational machinery requires the trafficking of the gRNAs from the cell nucleus to the cytoplasm. From a biological point of view this phenomenon can be contextualized considering that unlike other RNA viruses that have IRESs as would be the case of the picornaviruses, whose replicative cycle is confined to the cell cytoplasm, retroviruses perform a replicative cycle that takes place between the nucleus and cytoplasm of the cell, being the nucleus the place of synthesis of the gRNAs. In this way, during the synthesis of retroviral gRNAs, different cellular proteins would interact, directly or indirectly, with the gRNA forming at least one ribonucleoprotein complex (RNP) which would participate in the viral gRNA export stage and could subsequently regulate the association of viral gRNA with the translational machinery. Considering this possibility, the objective of this work was to identify at least one cellular protein that forms part of the RNP-complex and that participates in the regulation of IRES dependent mRNA translation initiation of HIV-1, HTLV- 1 and MMTV. Through an in silico analysis, it was determined that the 5'UTR region of MMTV gRNA possesses putative binding sites for the PTB1 protein. Subsequently, and through functional tests, we determined that the PTB1 protein binds in vitro and in vivo to the 5'UTR region and acts as a trans-acting factor for the IRES element. In the search for new ITAFs for retroviral IRES elements, we performed a GRNA assay coupled to a mass spectrometry test. This allowed us to identify different cellular proteins associated with the 5'UTR regions of HIV-1 and HTLV-1, among which nucleolin and hnRNPU proteins were found. The results obtained for nucleolin indicate that silencing the gene expression of the protein does not impact on translation, while an overexpression of the protein only increase the activity of the HTLV-1 IRES. On the other hand, the results obtained with hnRNPU allowed us to determine that the protein binds to the 5'UTR region of HIV-1 and HTLV-1 and acts as a trans-acting factor for the IRES translation initiation on the three retroviral IRES under study. The results obtained in this work allowed us to identify new cellular ITAFs that participate in the IRES translation initiation of HIV-1, HTLV-1 and MMTV